正常人肝10種細(xì)胞色素P450及微粒體蛋白含量、活性研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是肝臟的主要藥物代謝酶，參與臨床70％～80%常用藥物的代謝，主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等10種亞型。CYP代謝藥物活性的不同是臨床藥物反應(yīng)個體差異的主要原因，主要表現(xiàn)在酶基因多態(tài)性和含量差異性兩個方面。
　　CYP基因多態(tài)性的研究成果已得到廣泛認(rèn)可，但

2、尚不足以完全解釋藥物的個體差異。CYP含量差異性是藥物個體差異的另一重要影響因素，但正常人肝CYP含量的大樣本研究至今尚無報道。究其原因，正常人肝標(biāo)本來源受限和缺乏準(zhǔn)確可靠的定量方法是困擾CYP研究的重要因素。目前，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)發(fā)展迅速，穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)-多反應(yīng)監(jiān)測-質(zhì)譜技術(shù)（Multiple Reaction Monitoring coupled with Stable Isotope Dilution Mass S

3、pectrometry，SID-MRM-MS）已成為目前蛋白質(zhì)定量的較為理想的方法。由于缺乏正常人肝CYP含量標(biāo)準(zhǔn)，酶含量差異性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、遺傳及其表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制尚無法開展系統(tǒng)研究。因此研究正常人肝CYP含量，并探討其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，對進(jìn)一步探討藥物代謝酶對藥物代謝個體差異的影響，指導(dǎo)臨床個體化合理用藥，具有重要的理論和實際意義。
　　每克肝組織中的微粒體含量（Microsomal Protein Per Gr

4、am of Liver，MPPGL）是影響 CYP代謝個體差異的另一重要因素，也是生理藥代動力學(xué)模型（Physiologically-Based Pharmacokinetics，PBPK)中將藥物體外代謝清除率推至體內(nèi)清除率過程中的一個重要校正因子。為了正確地預(yù)測藥物體內(nèi)的代謝清除率，需準(zhǔn)確測定MPPGL的含量及含量的個體差異，至今尚無大樣本正常人肝微粒體蛋白生理含量的研究報道。
　　體內(nèi)體外外推（In Vitro-In Viv

5、o Extrapolation，IVIVE)給研究者提供了在研究體內(nèi)藥代動力學(xué)之前獲得藥物代謝定量數(shù)據(jù)的機(jī)會。通常，IVIVE時，用的是各參數(shù)的平均值，只能得到單點(diǎn)的體內(nèi)清除率，常常導(dǎo)致預(yù)測的偏差。如果用參數(shù)的個體數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測，即可得到體內(nèi)清除率的范圍，降低預(yù)測的偏差，為臨床提供更加可靠的數(shù)據(jù)。
　　本課題擬以已收集的正常人肝標(biāo)本為研究對象，采用qPCR的方法，對107例正常人肝10種CYP的mRNA進(jìn)行定量；采用SID-MRM-

6、MS對100例正常人肝10種CYPs亞型含量進(jìn)行定量，明確正常生理范圍，發(fā)現(xiàn)個體差異程度；對107例正常人肝中調(diào)控CYPs各種亞型的轉(zhuǎn)錄因子及miRNA進(jìn)行定量，從轉(zhuǎn)錄水平及表觀遺傳學(xué)角度闡述影響酶含量的機(jī)制；選用特異性探針，研究10種CYP亞型水平的酶動力學(xué)，明晰藥物代謝的個體差異程度。對10種CYP亞型進(jìn)行基因分型，明確基因多態(tài)性對CYP含量及活性的影響，發(fā)現(xiàn)基因型對個體差異的影響程度。
　　另外，測定128例正常人肝MPPG

7、L的含量，明確正常生理范圍，發(fā)現(xiàn)個體差異程度；測定10種CYP在微粒體水平與肝臟水平的代謝活性，比較兩種活性之間的差異。另外，用78例樣本MPPGL、CLint等5種參數(shù)個體數(shù)據(jù)預(yù)測CYP2C9探針?biāo)幬锛妆交嵌‰弩w內(nèi)肝清除率的個體差異，以期為基于 PBPK的體內(nèi)清除率預(yù)測提供生理參數(shù)。
　　1、方法：
　　1.1人肝標(biāo)本收集128例肝功能正常的人肝組織樣本。其中男性40例，女性88例，平均年齡47.2歲。吸煙或飲酒者各13例

8、。
　　1.2人肝微粒體的制備及微粒體蛋白含量的測定差速離心法制備人肝微粒體(Human Liver Microsome，HLM)，采用Bradford法測定微粒體蛋白濃度。
　　1.3 CYP基因多態(tài)性的測定選擇在中國漢族人群中基因多態(tài)性發(fā)生頻率在1%以上的位點(diǎn)，對10種 CYP亞型進(jìn)行基因分型，共25個多態(tài)性位點(diǎn)，用SNP MassARRAY分型檢測。
　　1.4熒光定量PCR測定mRNA及miRNA的表達(dá)將1μg

9、的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，兩步法在7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miRNA定量先將1μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5倍稀釋后三步法在進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　1.5 SID-MRM-MS測定人肝微粒體CYP亞型蛋白的含量將10種CYP亞型的特異性肽段序列整合在一個QconCAT蛋白序列中，用大腸桿菌表達(dá)同位素標(biāo)記該蛋白序列，純化后，和待測樣品一起酶切，脫鹽后Triple TOF56

10、00+質(zhì)譜儀進(jìn)行SID-MRM-MS分析定量。
　　1.610種CYP亞型酶活性的測定100μl的人肝微粒體孵育體系中分別加入不同濃度的系列CYP的特異性底物、EDTA、磷酸鹽緩沖液、氯化鎂等，37℃預(yù)孵育后加入 NADPH啟動反應(yīng)，后加冰乙腈、乙酸乙酯或高氯酸終止反應(yīng)，用HPLC-UV或HPLC-FLD進(jìn)行分析測定。
　　1.7 MPPGL含量測定通過同時測定同一樣品肝勻漿及HLM中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（P

11、OR）的活性計算MPPGL。MPPGL（mg/g）=每克肝臟POR活性/每毫克HLM的POR活性=nmol Cyt.c min-1 g-1/nmol Cyt.c min-1mg-1
　　1.8甲苯磺丁脲肝清除率的預(yù)測先將甲苯磺丁脲的體外清除率（CLint,in vitro）轉(zhuǎn)化成整肝清除率（CLint,liver），再用充分?jǐn)嚢枘Ｐ瓦M(jìn)行預(yù)測，用每一例樣本的5種參數(shù)（MPPGL，CLint，in vitro，LW，QH及BW）數(shù)據(jù)進(jìn)

12、行預(yù)測，得到體內(nèi)肝清除率的范圍。預(yù)測準(zhǔn)確度用AFE(Average Fold-error，平均誤差倍數(shù))判定。
　　1.9統(tǒng)計方法 SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Prism5.0軟件作圖。因本實驗大部分?jǐn)?shù)據(jù)為非正態(tài)分布，用非參數(shù)檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、結(jié)果：
　　2.1人肝中10種CYP的表達(dá)
　　2.1.1人肝微粒體中CYP亞型蛋白含量100例正常人肝中10種CYP亞型

13、含量均呈非正態(tài)分布。含量為4.62（CYP2B6）到102.04pmol/mg（CYP2E1）（中位數(shù)），CYP3A4含量個體差最大，129倍，其它CYP含量差異倍數(shù)為11~100倍。除了7對CYP之外，其它的CYP亞型蛋白含量之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.1.210種CYP mRNA的表達(dá)100例正常人肝中10種CYP的mRNA均呈非正態(tài)分布。相對表達(dá)水平0.19（CYP2D6）到5.94（CYP2E1）（中位

14、數(shù)）。CYP2A6表達(dá)水平個體差異倍數(shù)最大，168倍，其它 CYP mRNA表達(dá)水平差異倍數(shù)為8~122倍。除了4對CYP之外，其它的CYP mRNA表達(dá)水平之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.1.3 CYP mRNA與相應(yīng)蛋白之間的相關(guān)性只有CYP1A2、CYP2A6的mRNA與蛋白含量具有顯著相關(guān)性（P<0.01)。
　　2.2 CYP表達(dá)水平的影響因素
　　2.2.1轉(zhuǎn)錄因子4種轉(zhuǎn)錄因子PXR、HNF

15、4α、CAR及AHR的mRNA水平均呈非正態(tài)分布，表達(dá)水平均較低，但個體差異較大，從12到85倍。除PXR與AHR之外，其它的轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)水平之間均有顯著相關(guān)性(P<0.05)。
　　除了AHR與CYP2C9、CYP2D6之外，其它的轉(zhuǎn)錄因子與CYP在mRNA表達(dá)水平之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平與CYP的蛋白含量之間的相關(guān)性較差。
　　2.2.2 miRNA7種miRNA表達(dá)水平

16、均呈非正態(tài)分布。其中miRNA-27b在肝組織中的表達(dá)豐度最高，miRNA-34a豐度較低。miRNA-27b個體差異達(dá)618倍，其它 miRNA的差異倍數(shù)為89~312倍。7種 miRNA之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.019)。
　　miRNA與CYP的mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miRNA與與部分CYP的蛋白含量有顯著相關(guān)性；miRNA與CYP的蛋白翻譯效率無著性相關(guān)(P>0.05)。
　　2.2.3基

17、因多態(tài)性
　　CYP基因多態(tài)性對 mRNA的影響 CYP1A2-3113A>G、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2D6100C>T(*10)、CYP2D61661G>C、CYP3A5 A>G(*3)突變對mRNA表達(dá)水平有顯著影響（P<0.05）。
　　CYP基因多態(tài)性對蛋白含量的影響 CYP1A25347C>T、CYP1A22159G>A、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2C9*3、CYP2D6*10、

18、CYP2D61661G>C、CYP2E1-1293G>C、CYP2E17632T>A、CYP2E1-333T>A與CYP3A5 A>G突變對蛋白含量有顯著影響。
　　2.2.4人口學(xué)因素男性組 CYP1A2的mRNA表達(dá)水平顯著高于女性組（P=0.014）；隨著年齡的增加CYP2B6、CYP3A4、CYP2C8、CYP2C9及CYP2C19的mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；隨著年齡的增加，CYP3A5蛋白含量明顯增加(P<0

19、.05)。
　　2.310種CYP亞型水平活性90例樣本中10種CYP亞型的Vmax、Km和CLint活性均呈非正態(tài)分布。10種CYP Km為1.9~230.4μm/L（中位數(shù)），Vmax為1.2~21 pmol/min/pmolCYP（中位數(shù)），CLint為0.012~10.8μl/min/pmolCYP（中位數(shù)）。10種CYP亞型酶動力學(xué)參數(shù)存在大的個體差異，Vmax的個體差異9~1697倍；CLint為23~625倍；Km個

20、體差異相對較小，為3~40倍。
　　除 CYP2C19之外，其它的CYP亞型水平 Vmax之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。除了CYP2C19與5種CYP，CYP3A5與4種CYP均無相關(guān)性之外，其它的CYP亞型水平CLint之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。10種CYP亞型Km之間的相關(guān)性較差，僅7對CYP之間有相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.4基因多態(tài)性對10種 CYP亞型水平活性的影響 CYP1A25347C

21、>T、CYP1A22159G>A、CYP2A*4、CYP2A6*9、CYP2D6*10、CYP2D61661G>C及CYP3A5*3對酶動力學(xué)參數(shù)有顯著影響（P<0.05）。
　　2.5 MPPGL含量128中國正常人肝樣本的MPPGL呈非正態(tài)分布。MPPGL的平均含量為39.46 mg/g liver，范圍6.71到127.95mg/g liver，個體差異19倍。性別、年齡、吸煙、飲酒及臨床診斷對MPPGL含量均無顯著影響(P

22、>0.05)。
　　2.6 CYP微粒體水平與肝組織水平活性10種CYP微粒體水平的活性（轉(zhuǎn)化速率）31.50~677.94pmol/min/mg protein（中位數(shù)），個體差異6~232倍。用每個個體微粒體水平的活性乘以其相對應(yīng)的MPPGL的含量，代表每克肝組織水平CYP的活性（轉(zhuǎn)化速率）。肝組織水平CYP活性0.96-29.05 nmol/min/g liver，個體差異23~210倍。
　　除了CYP2C19之外，

23、肝臟水平CYP活性的個體差異均高于微粒體水平。9種CYP肝臟水平活性個體差異的倍數(shù)變化比相對應(yīng)的微粒體水平活性的個體差異倍數(shù)分別高18%~278%。與微粒體水平活性相比，肝臟水平的活性在10種CYP中的每一種都有較大的位次改變。CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9和CYP2E1，分別有47%、41%、40%和41%的樣本位次變化幅度超過20%。
　　2.7甲苯磺丁脲體內(nèi)肝清除率的預(yù)測7種方法預(yù)測的甲苯磺丁脲的肝清除率的平均值均

24、為0.113 ml/min/kg，但預(yù)測范圍區(qū)間則有明顯的差異。方法G為目前通用的預(yù)測方法，用各種參數(shù)的平均值預(yù)測，僅僅得到肝清除率的預(yù)測平均值；本實驗所用的方法A，78例樣本每個個體的5種參數(shù)，預(yù)測出甲苯磺丁脲的肝清除率的變異區(qū)間0.012~0.558 ml/min/kg，個體差異51倍。
　　3、結(jié)論：
　　1.提供了正常人肝10種CYP亞型蛋白及微粒體蛋白含量的正常值，兩者均有明顯個體差異。
　　2.提出新的CY