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文檔簡介
1、用異硫氰酸胍法、CTAB法和Trizol法等三種方法提取飛機草總RNA均取得較好效果,但異硫氰酸胍法最適合本實驗使用。根據菊科植物紫莖澤蘭P450CYP75基因(AY954290)和擬南芥CYP75家族成員的核酸序列同源區(qū)設計引物,用RT-PCR方法首次從飛機草、澤蘭、佩蘭中獲得大小分別為467bp、467bp、470bp的cDNA序列,分別命名為:FJC.CYP.M;ZL.CYP.M;PL.CYP.M。同源性分析表明,3個序列同源性達
2、99%,同時與AY954290具有90%的同源性,說明它們都來自細胞色素CYP75家族。
根據FJC.CYP.M核酸序列設計特異性引物,通過RACE-PCR方法克隆飛機草P450基因全長。3'RACE-PCR得到309bp cDNA序列,PolyA尾巴出現,命名為FJC.CYP.3。5'RACE.PCR得到702bp cDNA序列,命名為FJC.CYP.5。經比對發(fā)現,它與紫莖澤蘭CYP75基因全長還差364bp,因此繼續(xù)
3、從紫莖澤蘭CYP75基因前端設計上游引物,從FJC.CYP.5核酸序列設計下游引物,進行PCR,克隆得到一條長為384bp的cDNA序列,命名為FJC.CYP.5e。把所有飛機草細胞色素p450片段測序結果進行拼接,得到長為1653bp的cDNA序列,命名為FJC.CYP.COM,推導編碼509個氨基酸,開放閱讀框為31bp-1560bp,出現了3個經典的細胞色素P450氨基酸保守區(qū)域,其中一個為F××G×R×C×G,起始密碼子ATG前
4、27bp處出現了啟動子序列TATAbox。功能預測表明飛機草P450蛋白為一個親水性穩(wěn)定蛋白,有內外膜共9個跨膜螺旋,定位于線粒體中。
根據澤蘭、佩蘭中間片段設計引物,進行3'RACE-PCR,分別得到兩條長為340bp、625bp的cDNA片段,分別命名為ZL.CYP.3、PI.CYP.3。經比對,初步推測ZL.CYP.3片段基因屬于P450家族里某個葉綠體束縛蛋白基因,其具體的功能還有待進一步研究;PL.CYP.3片段
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