人細(xì)胞色素P450 2D6單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：細(xì)胞色素P450(cytochrome p-450，CYP)2D6是CYP酶系中1個(gè)重要的亞型，其參與多種藥物的代謝。制備抗人CYP2D6的單克隆抗體，為研究CYP2D6在藥物代謝中的作用提供新的工具與思路。 方法：以正常成人肝臟總蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠后，取小鼠的脾細(xì)胞與同系小鼠來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞融合，融合細(xì)胞在含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基喋呤(aminopterin)、胸腺嘧啶(thymine)

2、和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，得到雜交瘤細(xì)胞。建立ELISA法以及CYP2D6特異性底物右美沙芬體外代謝實(shí)驗(yàn)法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選出培養(yǎng)液對(duì)右美沙芬的代謝有抑制作用的陽(yáng)性細(xì)胞株，有限稀釋法對(duì)細(xì)胞稀釋、培養(yǎng)后，再篩選。得到分泌特異性CYP2D6抗體的雜交瘤細(xì)胞，獲得CYP2D6的單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)。測(cè)定其對(duì)右美沙芬代謝的抑制率，并比較單克隆抗體與化學(xué)抑制劑奎尼丁對(duì)右美沙芬代謝抑制率

3、的影響。 結(jié)果： (1)用正常人肝臟總蛋白免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合得到了雜交瘤細(xì)胞。 (2)應(yīng)用ELISA方法，篩選468孔培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，共得到分泌IgG抗體的陽(yáng)性孔135個(gè)，陽(yáng)性率為28.85％。最后選擇68孔繼續(xù)篩選。 (3)經(jīng)右美沙芬體外代謝抑制試驗(yàn)，在68孔細(xì)胞中篩選出了1個(gè)孔的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)三次有限稀釋法培養(yǎng)和右美沙芬體外代謝抑制試驗(yàn)再篩選，對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行純化，確認(rèn)其是

4、單克隆細(xì)胞。這個(gè)單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以有效抑制CYP2D6對(duì)其特異性底物右美沙芬的代謝作用，抑制率達(dá)到90.21％。 (4)比較獲得的mAb抗與奎尼丁對(duì)右美沙芬代謝的影響，在加入的細(xì)胞培養(yǎng)液量為10、20、30、40、50 μ 1時(shí)，mAb對(duì)右美沙芬的代謝抑制率分別為：90.15％、89.83％、89.86％、89.70％和89.89％；在加入的奎尼丁的終濃度分別為0.5、1、2、4、8 μ g/ml時(shí)，奎尼丁對(duì)右美沙芬的代謝