蚯蚓細(xì)胞色素P450基因的克隆及CYP1A2的蛋白表達(dá)特征研究.pdf

1、蚯蚓是土壤中生物量最大的動(dòng)物類群之一，具有重要的生態(tài)功能。同時(shí)蚯蚓對(duì)于土壤中污染物的降解具有重要作用，是土壤生態(tài)毒理研究的重要指示生物。細(xì)胞色素P450酶是一類在生物體中廣泛存在的代謝酶系，又稱為多功能氧化酶、藥物代謝酶或單加氧酶等。由于P450酶具有種類多樣性和底物特異性的特點(diǎn)，使得這類酶能夠催化多種類型的反應(yīng)。細(xì)胞色素P450酶不僅參與一些內(nèi)源物質(zhì)的代謝，如激素、脂肪酸等，還在許多外源物質(zhì)如環(huán)境污染物的代謝中起著重要作用。
　

2、　目前關(guān)于蚯蚓生態(tài)毒理的研究主要集中于利用蚯蚓作為指示生物對(duì)土壤環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)，常見(jiàn)的可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的蚯蚓體內(nèi)的生物標(biāo)志物主要有金屬硫蛋白、抗氧化酶、體腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)與DNA損傷等。對(duì)于蚯蚓體內(nèi)的P450基因克隆和蛋白表達(dá)方面的研究很少。
　　本文通過(guò)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR和RACE-PCR的技術(shù)成功從蚯蚓中提取出一條細(xì)胞色素P450基因，并對(duì)其分類地位上相似的動(dòng)物P450進(jìn)行進(jìn)化上的比對(duì)和蛋白表達(dá)分析。然后以赤子愛(ài)勝蚓

3、、多肉遠(yuǎn)盲蚓和威廉腔蚓為試驗(yàn)材料，提取這三種蚯蚓的整體組織蛋白，以及赤子愛(ài)勝蚓不同器官和不同成長(zhǎng)階段的組織蛋白進(jìn)行提取，測(cè)定蛋白濃度，采用Western-blot免疫印跡方法檢測(cè)分析了細(xì)胞色素P450酶系中的亞酶CYP1A2的蛋白表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)使用特異性引物成功的從蚯蚓體內(nèi)克隆出一條編碼P450的基因（命名為EW1）。該序列總長(zhǎng)1004bp，編碼區(qū)全長(zhǎng)492bp，編碼163個(gè)氨基酸，提交至 GenBank所得序

4、列號(hào)：ID:KM881474。該序列含有典型的細(xì)胞色素P450保守區(qū)域，包括：血紅素結(jié)合區(qū)域FXXGXXXCXG，P450蛋白活性位點(diǎn)螺旋I；位于螺旋C中與血紅素結(jié)合有關(guān)的序列W xxx R，能夠與亞鐵功能區(qū)域的自由基發(fā)生作用；包含在螺旋K內(nèi)的序列E xx R，是所有P450蛋白內(nèi)最容易識(shí)別的序列。
　　從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了來(lái)自10個(gè)物種的P450基因序列，結(jié)合蚯蚓的P450基因序列，利用MEGA5.0獲得了進(jìn)化樹。對(duì)進(jìn)

5、化樹進(jìn)行分析表明，蚯蚓的P450序列 EW1與渦蟲（Schmidtea mediterranea）P450的同緣關(guān)系最近，其次是曼氏血吸蟲（Opisthorchis felineus）和日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）的P450基因，同緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是文蛤蜊（Meretrix meretrix）。
　　應(yīng)用蛋白模擬軟件Phyre2對(duì)克隆到的蚯蚓P450進(jìn)行同源模建，以數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的三維結(jié)構(gòu)為模板，得到蚯蚓P

6、450序列的三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的為CYP45027家族，其中與人的CYP27B家族同源性最高，三維結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)97％，對(duì)比人的CYP27B的活性中心，在結(jié)構(gòu)的相應(yīng)位置找到了蚯蚓P450的活性中心。
　　CYP1A2蛋白表達(dá)研究結(jié)果表明不同發(fā)育時(shí)期的赤子愛(ài)勝蚓的CYP1A2蛋白表達(dá)量有顯著差異（P<0.05）。其中在成體蚯蚓中的表達(dá)最高，其次是亞成體，在蚯蚓幼體中的表達(dá)最低。CYP1A2蛋白在赤子愛(ài)勝蚓的不同器官中的

7、表達(dá)也有顯著差異（P<0.05）。通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，在腸中的表達(dá)最高，顯著高于受精囊和體壁（P<0.05），而在受精囊和體壁中有表達(dá)但是二者差異不顯著（P＞0.05）。另外，在赤子愛(ài)勝蚓、威廉腔蚓和多肉遠(yuǎn)盲蚓三種不同種類蚯蚓中CYP1A2蛋白的表達(dá)有一定差異但差異不顯著（P＞0.05）。
　　本論文首次克隆出了一條蚯蚓的細(xì)胞色素P450基因，同時(shí)首次鑒定出CYP1A2在蚯蚓體內(nèi)的表達(dá)情況。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步研究蚯蚓對(duì)污染物的代謝與