棉鈴蟲細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)、純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、盡管P450s酶系在昆蟲中的重要性已經(jīng)十分清楚,但由于多型P450共存于同一昆蟲體中,要真正了解和調(diào)控P450的功能,需要剖析不同P450的底物特異性,首先必須分離純化單型P450,因此P450分離純化在P450研究中具有重要的意義.棉鈴蟲是一種在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的重要害蟲,能導(dǎo)致多種不同作物的嚴(yán)重?fù)p失.為深入了解棉鈴蟲P450的結(jié)構(gòu)與功能,我們就棉鈴蟲P450的誘導(dǎo)、分離純化及性質(zhì)進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下.比較萘、五甲基苯、槲皮

2、素、蕓香苷和單寧酸對棉鈴蟲微粒體P450含量的影響發(fā)現(xiàn);萘和五甲基苯能明顯誘導(dǎo)微粒體P450,中腸微粒體P450的含量分別提高了2.60和2.34倍,脂肪體微粒體P450的含量分別提高了2.51和3.15倍.槲皮素、蕓香苷和單寧酸對脂肪體微粒體P450未表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用,對中腸微粒體P450有一定的抑制作用,并導(dǎo)致棉鈴蟲對溴氰菊酯的敏感性增加.對CHAPS、Lubrol PX、Emulgen 911和膽酸鈉四種去垢劑的比較研究發(fā)現(xiàn):CHA

3、PS對中腸和脂肪體微粒體P450的增溶效率最高,Lubrol PX、Emulgen 911和膽酸鈉較差.CHAPS增溶中腸和脂肪體微粒體P450的最適濃度分別為0.5％和0.5％或0.8％.在0.5％濃度下,四種去垢劑均未使中腸和脂肪體微粒體P450變性.PEG沉淀法被用于P450的初步純化.當(dāng)PEG的濃度為2％時,約30％的微粒體蛋白和10％的P450被沉淀;PEG為5％時,約55％的微粒體蛋白和20％的P450被沉淀;PEG為8％時

4、,約78％的微粒體蛋白和30％的P450被沉淀;PEG為11％時,約85％的微粒體蛋白和70％的P450被沉淀.其中,8％CHAPS適合于微粒體P450的初步純化.經(jīng)PEG沉淀后,中腸微粒體P450純度提高了2.1倍,回收率為72％;被沉淀出的蛋白主要集中在14.4-40kDa和66-97kDa范圍內(nèi).該文建立了HPHIC(Phenyl-5PW)分離P450的優(yōu)化條件:①檢測波長為405nm;②流速0.5ml/min;③50min線性梯

5、度洗脫,從100％HICA<,2>至100％HICB.在該條件下,中腸微粒體經(jīng)HPHIC分離后,P450主要存在于餾分7(t<,R>=39′0″-44′0″)和餾分8(t<,R>=44′01″-49′0″)中;與微粒體相比,P450純度提高3.04倍,回收率為55.3％.該文還建立了HPIEC(DEAE-5PW)分離P450的優(yōu)化條件:①檢測波長為405nm;②流速0.5ml/min;③40min線性梯度洗脫,從100％IECA<,2>