三個甜瓜ERF基因的克隆及初步功能分析.pdf

1、ERF(ethylene responsive factor)與乙烯信號轉導相關，是一類位于信號途徑下游的轉錄因子，可參與逆境應答、植物生長發(fā)育和果實的成熟。ERF轉錄因子屬于AP2/EREBP家族中的EREBP亞族，包含一個AP2/ERF結合域。在甜瓜（Cucumis meloL.）中已經克隆得到若干ERF轉錄因子基因，但與甜瓜果實成熟相關研究報道較少。甜瓜屬于葫蘆科甜瓜屬，果實具有豐富的營養(yǎng)，因此，深入研究與甜瓜果實成熟相關的ERF

2、轉錄因子功能已經成為必要。本研究根據甜瓜數據庫序列分別克隆得到三個ERF轉錄因子CmERFⅢ-12、CmERFⅢ-14、CmERFⅤ-2基因，分別編碼275、148、391個氨基酸，利用生物信息學軟件進行蛋白理化性質、磷酸化位點、信號肽結構、跨膜結構等相關性質預測。結果表明三個轉錄因子都具有親水性，有不同的磷酸化位點，不屬于分泌型蛋白，不具有跨膜結構，也不屬于膜蛋白;亞細胞定位預測顯示CmERFⅤ-2和CmERFⅢ-14很可能定位于細胞

3、核，CmERFⅢ-12在細胞質內分布較多，因此三個轉錄因子可能分別在細胞核和細胞質內發(fā)揮著調控作用。為研究其初步功能，構建CmERFⅢ-12、CmERFⅢ-14、CmERFⅤ-2基因超表達載體和RNAi干擾載體，利用農桿菌注射法在甜瓜果實中進行瞬時表達，通過實時定量PCR分別檢測轉化部位三個基因的表達特性和果實成熟相關基因的相對表達量。結果顯示，注射CmERFⅢ-14基因超表達載體部位果皮顏色出現(xiàn)提前變黃表型，注射干擾載體部位仍保持綠色

4、;注射CmERFⅤ-2基因超表達部位果皮顏色保持綠色，注射干擾載體部位出現(xiàn)變黃表型;分別注射CmERFⅢ-12基因超表達與干擾載體部位的果皮顏色表型不明顯。注射組織實時定量PCR檢測結果顯示:CmERFⅢ-14基因的過表達和干擾處理分別會激活和抑制果實成熟相關ACS4、EXP1、PSY1基因的表達。CmERFⅤ-2基因的過表達能抑制EXP1基因的表達。結合表型結果，CmERFⅤ-2基因可能推遲果實的成熟而CmERFⅢ-14基因會促進果實

5、的成熟，CmERFⅢ-12基因則對果實成熟的影響不大。構建攜帶有果實特異表達E8基因啟動子的報告載體pPZP-E8-GUS，以分別攜帶目的基因超表達載體為效應載體，通過葉片注射法共轉化本氏煙草（Nicotiana benthamiana），根據GUS活性變化，CmERFⅢ-12、CmERFⅢ-14轉錄因子基因能夠激活果實特異性E8啟動子促進基因的表達而增加GUS酶的相對活性，而CmERFⅤ-2則傾向于抑制E8啟動子降低GUS基因的表達而