飛蝗漆酶基因mRNA表達及功能研究.pdf

1、漆酶(Laccase)屬于酚氧化酶，是一種結(jié)合多個銅離子的蛋白質(zhì)，可將酚類物質(zhì)（如多巴胺）氧化成相應(yīng)的醌，在昆蟲的生長發(fā)育和變態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用。漆酶主要參與昆蟲表皮鞣化，促進表皮的硬化和暗化，這個過程對于昆蟲的生長發(fā)育至關(guān)重要。直翅目昆蟲飛蝗是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，常暴發(fā)成災(zāi)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴重威脅。目前，漆酶在分子水平上的研究主要集中在完全變態(tài)昆蟲，而在不完全變態(tài)昆蟲中尚未見報道。本文以飛蝗Locustamigratoria為研究對象

2、，對漆酶基因（Laccase）進行了分子特性及功能研究，這對深入了解漆酶在飛蝗表皮形成過程中的作用提供了基礎(chǔ)資料，豐富了目前昆蟲漆酶的研究內(nèi)容，同時為研發(fā)以該酶為靶標的新型飛蝗綠色防控新技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。本文主要研究內(nèi)容有如下三個方面:
　　一、飛蝗漆酶基因的克隆及序列分析
　　基于飛蝗表達序列標簽(Expressingsequencetag，ESTs)數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法獲得2條漆酶ESTs，經(jīng)比對確定其分別為Lac

3、case1和Laccase2cDNA序列片段，分別將其命名為LmLac1和LmLac2。其中LmLac1的部分核苷酸序列長為757bp，編碼252個氨基酸;LmLac2的部分核苷酸序列長為509bp，采用RACE技術(shù)克隆獲得2026bpLmLac2cDNA序列，其中開放式閱讀框(ORF)為1866bp，編碼621個氨基酸，3'非編碼區(qū)(3'-UTR)的長度為160bp。
　　二、飛蝗漆酶基因在不同發(fā)育階段及不同組織部位的mRNA表

4、達分析
　　采用qPCR技術(shù)對漆酶基因在不同齡期和不同組織部位的mRNA表達水平進行了分析。結(jié)果顯示:LmLac1主要在中腸表達，而LmLac2在體表特異性表達;LmLac1在各個齡期都有表達，其中在卵期表達量最低，成蟲期第5天表達量達到最高;LmLac2在5齡第一天不同時間段的表皮中(0h，2h，4h，8h，24h)都有表達，且隨著體表暗化程度的加深，表達量呈上升趨勢，之后，LmLac2在5齡每一天均有表達，雖然表達量最高的第1

5、天是表達量最低的第5天的3.9倍，但統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異。
　　三、飛蝗漆酶基因的功能研究
　　采用RNAi技術(shù)研究飛蝗漆酶基因在生長發(fā)育過程中的功能。飛蝗4齡若蟲注射dsRNA(dsLmLac1/dsLmLac2)后，檢測到目標基因的表達均被有效沉默。dsLmLac1注射組與dsGFP注射組相比，體壁鞣化程度相同，且無致死現(xiàn)象;dsLmLac2注射組中，若蟲蛻至下一齡期均出現(xiàn)體色變淡，蟲體變軟，活動能力下降等現(xiàn)象。為了進

6、一步研究LmLac2基因沉默后是否對之后各發(fā)育齡期若蟲的表皮鞣化都有影響，選取2齡第1天若蟲注射dsRNA，之后取每一齡期的表皮做石蠟切片觀察分析，發(fā)現(xiàn)dsLmLac2注射組的若蟲在蛻至3齡和4齡后與對照組相比，其表皮明顯變薄，但蛻至5齡的若蟲表皮厚度與對照組無差異。這些結(jié)果表明，漆酶LmLac1不是表皮鞣化所必需的，而LmLac2對飛蝗表皮的硬化和暗化起著重要的作用。
　　四、中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因的mRNA表達及功能

7、>　　根據(jù)已知中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因（OcCHS1）保守區(qū)域部分cDNA序列（GenBank登錄號:HM214491），運用RT-PCR和qPCR技術(shù)分析mRNA表達特性，采用RNA干擾技術(shù)研究其生物學(xué)功能。結(jié)果表明，OcCHS1在中華稻蝗各齡期都有表達，其體表為高表達，其次是氣管，其它組織部位表達量低。RNA干擾實驗發(fā)現(xiàn)，4齡第4天若蟲注射OcCHS1的雙鏈RNA(dsRNA)后，與對照組相比，OcCHS1mRNA表達量被沉默了7