具細(xì)菌漆酶活性的芽孢外壁蛋白CotA基因克隆及異源表達(dá)研究.pdf

1、本文從五常林區(qū)和涼水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的森林土壤中篩選出一株具有高漆酶活性的細(xì)菌菌株,通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA分析,鑒定該細(xì)菌屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis,定名為Bacillus subtilis WD23。該菌株的產(chǎn)芽孢率與其細(xì)菌漆酶酶活成正相關(guān),說明該芽孢桿菌的外壁蛋白具有漆酶活性,可能來源于芽孢外壁組成蛋白CotA。使用B.subtilis WD23芽孢對(duì)偶氮和葸醌類染料進(jìn)行脫色試驗(yàn),在2

2、4 h內(nèi)脫色率能達(dá)到50～90％,用其固定化的芽孢處理造紙黑液,處理7 d色度下降24.9％,COD下降31.2％。利用GenBank上公布的B.subtilis CotA基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物,克隆B.subtilis WD23的CotA基因,并轉(zhuǎn)化Escherich coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)其CotA蛋白表達(dá),分子量約為65 kDa,測定工程菌株發(fā)酵液的粗提液的漆酶活性

3、達(dá)到1700U/mL,表明該菌株漆酶活性來源于其芽孢外衣蛋白CotA。采用特異的His標(biāo)簽純化試劑盒對(duì)CotA蛋白進(jìn)行純化。CotA漆酶對(duì)RBBR和剛果紅的脫色率在87％以上,對(duì)靛紅和結(jié)晶紫的脫色率也達(dá)55％以上。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)利用銅離子作為篩選劑,從涼水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的土壤中篩選出一株具有高漆酶活性的菌株。其菌落在含0.2 mmol/LCu2+的培養(yǎng)基上呈灰白色而在不含Cu2+的培養(yǎng)基上呈淺紅色

4、。該菌株革蘭氏染色反應(yīng)呈陽性,菌體為短桿狀,1～21μm長,能形成芽孢,具有鞭毛和運(yùn)動(dòng)性,不能利用木糖和阿拉伯糖這兩種典型的枯草芽孢桿菌能利用的碳源。
　　 該菌株的16S rDNA片段長度為1513 bp,在GenBank中的登錄序號(hào)為EU780682。由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析,該菌株與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的同源性為100％。綜合其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rDNA分析,鑒定該細(xì)菌屬于Bacil

5、lussubtilis,將此菌株定名為Bacillus subtilis WD23。
　　 (2)通過對(duì)B.subtilis WD23的生物學(xué)特性研究,得出其最適生長溫度是30℃,最適生長pH為7.0,具有一定的抗鹽、抗銅、抗紫外線和抗H2O2的能力。
　　 (3)以丁香醛連氮作為底物,測定菌株WD23細(xì)菌芽孢漆酶的最適反應(yīng)溫度為60℃,最適反應(yīng)pH為6.8。B.subtilis WD23芽孢漆酶具有很好的熱穩(wěn)定性及pH

6、穩(wěn)定性,在80℃高溫下,其活性半衰期為2.5 h,在pH9.0,60℃的條件下,其活性半衰期達(dá)10d。EDTA、甲醇和Zn2+等化學(xué)物質(zhì)都強(qiáng)烈抑制細(xì)菌芽孢漆酶的活性,而Cu2+、Fe2+和Mg2+卻可以增強(qiáng)細(xì)菌芽孢漆酶的活性。B.subtilis WD23的芽孢漆酶在24 h之內(nèi)使RBBR和茜素紅脫色率達(dá)90％以上,剛果紅、甲基橙和結(jié)晶紫的脫色率也達(dá)50％以上,顯示了本研究所采用的細(xì)菌芽孢漆酶在染料降解上具有很大的應(yīng)用潛力。
　　

7、 (4)固定化芽孢漆酶最適反應(yīng)溫度為70℃。最適反應(yīng)pH為6.8。固定化芽孢漆酶貯存于30℃,pH6.8的封閉容器內(nèi),其活性半衰期t1/2超過7個(gè)月。固定酶的米氏常數(shù)Km較非固定化酶的米氏常數(shù)Km小。
　　 (5)采用固定式填充床裝置,利用固定化微膠囊處理造紙黑液,固定化菌株WD23的芽孢漆酶處理黑液的COD去除率為31.19％,固定化真菌新月彎胞霉處理黑液的COD去除率45.86％,二者聯(lián)合處理黑液的COD去除率卻能達(dá)到為6

8、1.31％,說明共代謝作用更有利于處理像造紙黑液這樣的難處理的復(fù)雜污染廢水。
　　 (6)以B.subtilis WD23總DNA為模板,擴(kuò)增得到1558 bp CotA基因,通過BLAST比對(duì),其與枯草芽孢桿菌的CotA基因同源性很高,達(dá)到99％,可見克隆的序列為CotA基因。
　　 (7)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET22b/CotA,測序得到CotA基因序列共有1542 bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登陸號(hào)為GQ1842

9、94,其氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登陸號(hào)為ACS44284。用陽性重組子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3),得到了CotA基因的異源表達(dá)菌株。
　　 用IPTG誘導(dǎo)CotA基因表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE檢測到表達(dá)的CotA蛋白在粗提液中,用丁香醛連氮作底物,測定粗提液的漆酶活性達(dá)到1700 U/mL,表明菌株WD23的漆酶活性來源其芽孢CotA蛋白。為了提高漆酶的產(chǎn)量,優(yōu)化了漆酶誘導(dǎo)表達(dá)條件,結(jié)果表明:誘

10、導(dǎo)劑IPTG的濃度為1.0 mmol/L,加入IPTG時(shí)菌液的OD600值為1.0,誘導(dǎo)溫度為25℃和誘導(dǎo)時(shí)間為15 h漆酶的產(chǎn)量最高。
　　 (8)利用BioEdit軟件對(duì)CotA氨基酸的親疏水性進(jìn)行分析,其親水性比較強(qiáng)的,表明其易于表達(dá)。
　　 利用BLAST軟件對(duì)B.subtilis WD23的CotA蛋白的保守結(jié)構(gòu)分析,其含有銅氧化酶超家族。用Clust X軟件將B.subtilis WD23的CotA氨基酸序列

11、與一些典型的細(xì)菌和真菌漆酶進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明其與真菌的漆酶氨基酸序列之間的相似度非常低,而與細(xì)菌漆酶如E.coli cueO、嗜熱棲熱菌、薰衣草鏈霉菌和抗生素鏈霉菌的漆酶之間的相似度也比較低,但與IGSK A(B.subalis CotA)的同源性很高。
　　 (9)采用特異的His標(biāo)簽純化試劑盒對(duì)CotA蛋白進(jìn)行純化的效果比較好,經(jīng)Native-PAGE,純化的CotA蛋白在pH5.0條件下被0.1％丁香醛連氮染成紅色。

12、>　　 以丁香醛連氮為底物測定CotA漆酶的最適反應(yīng)溫度為45℃,最適反應(yīng)pH為7.2。pH7.2條件下,80℃時(shí)CotA漆酶活性半衰期t1/2為0.5 h。在最適反應(yīng)溫度45℃下,pH9.0時(shí)CotA漆酶活性半衰期t1/2達(dá)到8 h。
　　 CotA蛋白的:Km值小于芽孢漆酶的Km值。CotA漆酶對(duì)RBBR和剛果紅的脫色率在87％以上,對(duì)靛紅和結(jié)晶紫的脫色率也達(dá)55％以上,此CotA漆酶在短時(shí)間內(nèi)對(duì)染料能夠有效地脫色,能夠成