蘇云金桿菌幾丁質(zhì)酶的分布及chiA、chiB基因的克隆和異源表達(dá).pdf

1、幾丁質(zhì)酶有抑真菌和殺蟲(chóng)增效的作用。因此蘇云金芽孢桿菌(簡(jiǎn)稱Bt)幾丁質(zhì)酶的研究對(duì)于擴(kuò)大Bt制劑的作用范圍，增強(qiáng)其殺蟲(chóng)作用有重要的意義。 本文利用幾丁質(zhì)平板法和chiB特異引物PCR兩種方法檢測(cè)了445株蘇云金芽孢桿菌。平板檢測(cè)結(jié)果表明，被測(cè)菌株都可以在以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，證明Bt菌株普遍含有幾丁質(zhì)酶。71.3％的菌株可以產(chǎn)生明顯水解圈，其中16.4％的菌株能產(chǎn)生較大的水解圈，具有較高的幾丁質(zhì)酶活性?；驒z測(cè)的結(jié)

2、果表明91.7％的菌株含有chiB基因。實(shí)驗(yàn)分別從酶水平和基因水平證明幾丁質(zhì)酶及其基因在Bt普遍存在。 通過(guò)分析Bt幾丁質(zhì)酶與其血清型和殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICP)的關(guān)系證明，幾丁質(zhì)酶活性的高低與這兩者之間沒(méi)有必然聯(lián)系。對(duì)峙法檢測(cè)了54株幾丁質(zhì)酶活性較高的蘇云金芽孢桿菌，篩選到12株抑小麥赤霉菌效果好的菌株。@2 以蘇云金芽孢桿菌科默爾亞種15A3(Bt 15A3)菌株基因組DNA為模版，用touchdown PCR方法擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶C

3、hiA和ChiB的全基因序列(GenBank登錄號(hào)：EF 103273和DQ 512474)。將PCR產(chǎn)物連接pUCm-T克隆載體，分別轉(zhuǎn)化E．coli XL-Blue，獲得重組質(zhì)粒pUCm-cMA和pUCm-ch/B。經(jīng)核苷酸及對(duì)應(yīng)氨基酸序列分析證明，chiA基因全長(zhǎng)1426bp，含有343 bp的上游非編碼區(qū)和1083 bp的ORF，編碼360個(gè)氨基酸。推測(cè)蛋白分子量36kD，只有一個(gè)幾丁質(zhì)酶催化域。chiB基因全長(zhǎng)2279 bp，

4、含有248 bp的上游非編碼區(qū)和2031 bp的ORF，編碼676個(gè)氨基酸。推測(cè)蛋白分子量71kD，具有三個(gè)相關(guān)結(jié)構(gòu)域。 在有無(wú)誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)E．coli(pUCm-chiA)和Ecoli(pUCm-chiB)發(fā)現(xiàn)，克隆的幾丁質(zhì)酶基因可以利用本身的啟動(dòng)子異源表達(dá)各自分子量的蛋白，不需要幾丁質(zhì)作為誘導(dǎo)物。證明Bt．15A3中兩種幾丁質(zhì)酶是組成型表達(dá)。 ChiA和ChiB幾丁質(zhì)酶的最適pH為5.5左右。最適溫度為5