蘇云金桿菌vip基因的鑒定與克隆.pdf

1、本研究利用溫度篩選法，對(duì)采自河北、貴州等部分地區(qū)的202份土壤樣品進(jìn)行分離，得到73株野生型蘇云金芽孢桿菌(Bt)菌株。晶體形態(tài)的鏡檢觀察和SDS-PAGE分析表明，大部分菌株都能表達(dá)約130kDa和60kDa的殺蟲(chóng)晶體蛋白。 利用vip3A基因通用引物Svip5/Svip3，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存和新分離的171株Bt菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，63株能夠獲得預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，分布率約為36.8％。PCR-RFLP結(jié)果顯示881

2、bp，255bp，186bp的片段，為vip3Aa1類基因，說(shuō)明vip3A基因極其保守，但是殺蟲(chóng)活性差異較大，其中菌株TF9和Bt16分別對(duì)甜菜夜蛾表現(xiàn)高度和中等活性。用全長(zhǎng)PCR方法分別從Bt16和TF9中克隆出vip3A基因，GenBank登錄號(hào)分別為EU332167和EU294496，Bt蛋白國(guó)際命名委員會(huì)正式命名為Vip3Aa27和Vip3Aa26。序列分析表明，vip3A-16基因和vip3A-TF9基因與已知vip3A基因的

3、序列相似性分別為96.75％～99.75％和96.67～99.58％。Vip3Aa27與已知Vip3A蛋白氨基酸序列相似性為97.34％～99.49％，Vip3Aa26與已知Vip3A蛋白氨基酸序列相似性為96.70％～99.11％。 將vip3A-16基因和vip3A-TF9基因分別克隆于表達(dá)載體pQE30，獲得了表達(dá)載體p30vip-16和p30vip-TF9，并轉(zhuǎn)化E.coliM15，SDS-PAGE和Western Bl

4、ot分析表明，IPTG誘導(dǎo)后均表達(dá)88.5kDa左右的Vip3A蛋白。蛋白可溶性分析表明，蛋白主要以包涵體形式存在，只有約10％可溶。生物測(cè)定結(jié)果表明，Vip3Aa27蛋白對(duì)粉紋夜蛾、甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)三種重要的鱗翅目害蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)的LC50值分別為0.125μg/mL，0.2381μg/mL和9.238μg/mL，毒力較高。而Vip3Aa26蛋白僅對(duì)敏感昆蟲(chóng)粉紋夜蛾有活性，LC50值為4.423μg/mL，對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)的抑制作用不明

5、顯。 利用PCR方法檢測(cè)vip1A/vip2A基因在野生型Bt菌株中的分布，進(jìn)行基因片段的克隆和序列分析。結(jié)合cry1基因的PCR-RFLP鑒定體系，分析與vip1A/vip2A基因有聯(lián)系的cry1類基因。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室171株野生型Bt菌株中，共有20株菌株含有vip1A/vip2A基因，分布率為11.69％。Western Blot分析驗(yàn)證了這些基因在菌株中都進(jìn)行了表達(dá)。成功克隆了菌株Bt16的vip1A/vip2A基因