蘇云金桿菌HZM2菌株的基因鑒定及對(duì)毒死蜱的降解作用.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是自然界中一種分布廣泛的革蘭氏陽性產(chǎn)孢細(xì)菌，占據(jù)著全世界95％的微生物農(nóng)藥市場。除了對(duì)許多目的昆蟲具有特異性的毒殺作用外，Bt還直接或間接地對(duì)線蟲、螨類、原生動(dòng)物甚至一些病原菌具備一定的活性。Bt具備這些特性，主要是因?yàn)樗w內(nèi)含有多種毒性因子，例如殺蟲晶體蛋白(ICPs)、營養(yǎng)期殺蟲蛋白(VIPs)、幾丁質(zhì)酶、AiiA和InhA等等，其中，ICPs是最為重要的殺蟲活

2、性因子。隨著人們對(duì)Bt的研究不斷深入，Bt的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)不僅只局限于農(nóng)業(yè)和林業(yè)上，在醫(yī)學(xué)上甚至工業(yè)上也能起到一定的作用，并且不斷有研究人員拓展Bt的應(yīng)用領(lǐng)域。基于以上原因，本研究不但著眼于研究Bt常規(guī)的殺蟲特性，從工業(yè)污染源中分離Bt菌株，測定它們的生理生化指標(biāo)、對(duì)小菜蛾、甘薯莖線蟲和桔小實(shí)蠅的活性，還分析其中的1個(gè)菌株HZM2的活性基因，克隆其中的cry基因，并嘗試將Bt用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥，鑒定了該菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的降解能力。

3、 應(yīng)用醋酸鈉-抗生素加熱處理的分離方法，對(duì)從工業(yè)污染源收集的220份樣品進(jìn)行了分離，從中得到6株Bt菌株，出菌率為2.7％。對(duì)新分離的這6株菌株的生理生化指標(biāo)的鑒定表明，這6株菌株的生理生化指標(biāo)均不完全相同。生物活性測定表明菌株HZM2對(duì)小菜蛾和甘薯莖線蟲的活力均為所有分離菌株中最高的，LC50分別為1.91μL/mL和10.93μL/mL。 運(yùn)用PCR-RFLP和PCR技術(shù)對(duì)菌株HZM2的部分生物活性基因進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯

4、示HZM2含有cry1Aa、cry1Ba、cry1Ea、cry1Ia和cry2Ab等ICPs基因及Vip3A、inhA、幾丁質(zhì)酶基因和aiiA等活性基因。從HZM2菌株中克隆得到1個(gè)cry1Ea基因。該基因全長3516 bp，蛋白編碼1171個(gè)氨基酸，蛋白分子量和等電點(diǎn)通過軟件預(yù)測分別為133.18 kDa和5.01。該基因已在GenBank上登錄(登錄號(hào)為EU244426)，并被Bt δ-內(nèi)毒素命名委員會(huì)命名為cry1Ea8，成為Bt

5、cry基因家族中1個(gè)新的成員。 利用生物信息學(xué)軟件分析編碼cry1Ea8基因的氨基酸序列，結(jié)果表明在該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，螺旋結(jié)構(gòu)占24.68％，折疊結(jié)構(gòu)占30.66％，成環(huán)結(jié)構(gòu)占44.66％，Cry1Ea8蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)應(yīng)該是球狀結(jié)構(gòu)，但不像結(jié)構(gòu)域一樣緊密。結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，Cry1Ea8由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，結(jié)構(gòu)域Ⅰ由2 19個(gè)氨基酸殘基(Thr35 to Leu253)組成；結(jié)構(gòu)域Ⅱ由197個(gè)氨基酸殘基(Thr258 to T

6、hr454)組成；結(jié)構(gòu)域Ⅲ由138個(gè)氨基酸殘基(lle464 to AsP601)組成。其中N-末端螺旋狀結(jié)構(gòu)域與膜插入和孔隙形成有關(guān)，而第2和第3個(gè)結(jié)構(gòu)域與受體的結(jié)合有關(guān)。此外，本研究首次鑒定Bt菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的耐受性及降解率。菌株HZM2對(duì)毒死蜱的耐受力可達(dá)1600 mg/L，利用氣相色譜(GC)檢測技術(shù)分析該菌株對(duì)毒死蜱的降解率，該菌株在48 h內(nèi)對(duì)200 mg/L毒死蜱的降解率為88.9％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，HzM2菌株對(duì)高濃度毒