毒死蜱降解細菌的篩選、降解特性及其固定化研究.pdf

1、有機磷農藥以其高效、廉價等特點而被廣泛應用，但其對人體健康和環(huán)境等影響較大是不容忽視的問題。目前國內外已報道的甲基對硫磷降解菌有假單胞菌（Pseudomonassp.）、黃桿菌（Flavobacterium sp.）、產堿菌（Alcaligenes sp.）和節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）
　　 等；毒死蜱降解菌有阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.）

2、和玫瑰紅紅球菌（Rhodocouus rhodochrous）等。但是已報道的細菌由于環(huán)境適應性不強等原因，還未達到開發(fā)利用的要求，因此仍需篩選更加高效的專性或兼性降解菌。
　　 另外，有關同一菌種的不同菌株對有機磷農藥的降解差異性也鮮有報道。本研究旨在尋找高效降解有機磷農藥的菌株，明確菌株的分類學地位，同時探討環(huán)境條件對菌株降解有機磷農藥的影響、單株菌的降解動力學和降解混合菌的構建。進一步提取降解酶，優(yōu)化產酶條件，明確降解酶的

3、酶促降解特性，進而研究優(yōu)勢菌株的固定化條件和特性。研究結果如下：
　　 1.采用直接分離與富集馴化培養(yǎng)相結合的方法，分離篩選出三株能夠降解有機磷農藥的菌株HY-1、HY-2和HY-4，在形態(tài)特征和生理生化分析的基礎上，又對其16S rDNA序列進行了分析，并研究了其對甲基對硫磷（Methyl-parathion）、毒死蜱（Chlorpyrifos）三唑磷（Triazophos）的降解特性。結果表明：三菌株為蠟狀芽孢桿菌（Baci

4、llus cereus）的不同菌株，三菌株在Genbank上的登錄號分別為：eu915687、eu915686和eu915688。
　　 三菌株在72 h內對初始濃度為50 mg/L甲基對硫磷的降解率分別達到91.7％、88.7％與92.4％，菌株之間無顯著性差異（P>0.05）；在毒死蜱初始濃度為50 mg/L和100 mg/L時，HY-1和HY-4降解毒死蜱的能力和HY-2有顯著性差異（P<0.05），其中三菌株在72 h內

5、對100 mg/L毒死蜱的降解率分別達到64.8％、53.7％和59.5％；三菌株在72 h內對初始濃度為100 mg/L三唑磷的降解率分布在13.3％-20.7％之間，其中HY-2對三唑磷的降解率較高，并和其余兩菌株有顯著性差異（P<0.05）?？梢钥闯?，蠟狀芽孢桿菌的不同菌株對有機磷農藥的降解存在差異性。
　　 2.以單因素試驗探討了三菌株降解甲基對硫磷和毒死蜱的影響因素，得出了三菌株降解有機磷農藥的最適環(huán)境條件。結果表明：

6、菌株HY-2能夠利用甲基對硫磷和毒死蜱為唯一磷源降解農藥。HY-2降解甲基對硫磷的適宜條件為：培養(yǎng)溫度30 ℃–35 ℃、初始pH為6–8、甲基對硫磷初始濃度為10–50 mg/L、接種量20％（體積比，菌體密度：稀釋到菌懸母液（OD600=3.0）的0.8倍），添加葡萄糖不能促進菌株對甲基對硫磷的降解；HY-2降解毒死蜱的適宜條件為：葡萄糖濃度6 g/L、培養(yǎng)溫度30 ℃–35 ℃、初始pH為7、毒死蜱初始濃度為80-200 mg/L

7、、接種量20％（體積比，菌體密度：稀釋到菌懸母液（OD600=3.0）的0.8倍）。HY-1和HY-4兩菌株降解毒死蜱的適宜條件為：葡萄糖濃度3G/L、培養(yǎng)溫度35℃、初始pH為7–8、毒死蜱初始濃度80 mg/L、接種量20％（體積比，菌體密度：稀釋到所配菌懸母液（OD600=2）的0.5倍）。酵母膏含量對毒死蜱的降解影響表明，當添加3G/L的葡萄糖時，最適的酵母膏含量為1 g/L，而不添加葡萄糖時，最適的酵母膏含量為5 g/L。在酵

8、母膏試驗濃度范圍之內，不添加葡萄糖時菌株對毒死蜱的降解率最終也不能達到含有葡萄糖的水平。
　　 3.采用種子液培養(yǎng)基中定量添加毒死蜱和定時取樣分析毒死蜱殘留濃度的方法，明確了毒死蜱對蠟狀芽孢桿菌的生長抑制動力學和菌株對毒死蜱的降解動力學，同時研究了降解菌對高濃度毒死蜱的耐受度和菌膠團的形成能力。結果表明：HY-1、HY-2和HY-4三菌株最適種子液培養(yǎng)時間分別為10、19和15 h。含毒死蜱培養(yǎng)液和空白對照相比，HY-1和HY-

9、2兩菌株生長的適應期延長，對數(shù)期、穩(wěn)定期順序后延。隨著培養(yǎng)液中菌體數(shù)量的增長，培養(yǎng)液的pH也隨之升高。接菌量為8％（V/V）時降解率最高。HY-1和HY-2兩菌株對不同濃度的毒死蜱表現(xiàn)出不同的降解規(guī)律。對于低濃度的毒死蜱，毒死蜱的濃度隨著時間的推移而下降；當毒死蜱濃度較高時，毒死蜱的降解過程包括吸附、解吸和降解等幾個階段。一級動力學方程ln（C0/Ct)=kt可以用來擬合毒死蜱的降解動力學及確定降解動力學參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，菌株HY-2比H

10、Y-1可以耐受更高的毒死蜱濃度，但HY-1的菌膠團形成能力要高于HY-2。
　　 4.為明確蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）混合菌株對毒死蜱的降解效果，本研究采用正交試驗的方法構建混合菌。以混合菌對毒死蜱的降解率和菌株的生長量為依據(jù)，利用單一因素試驗考察了不同因素對混合菌降解毒死蜱的影響。兩菌株組合時研究發(fā)現(xiàn)，HY-1和HY-4兩菌株的比例為1:1（V/V）時，對80 mg/L毒死蜱的降解率最高。添加葡萄糖有助于菌

11、株的生長，但是不利于毒死蜱的降解。偏堿性環(huán)境對菌株的生長有利，對毒死蜱的降解也有利。菌株的降解動力學研究發(fā)現(xiàn)，兩菌株混合對毒死蜱的降解和單菌的降解規(guī)律相似。兩菌株混合時能夠耐受20–70 g/L的NaCl濃度，且對80 mg/L毒死蜱的降解率都在41％以上。利用正交試驗構建的三菌株組合降解混合菌的體積比為：1:1:3。
　　 在含80 mg/L毒死蜱的基礎培養(yǎng)基中，接菌量為8％（V/V）時降解率最高，降解最適pH值為7。在試驗濃

12、度下，三菌株混合菌對毒死蜱的降解也符合一級動力學方程?；旌暇鷮Ω啕}具有很高的耐受度，當反應液中NaCl濃度在20–100 g/L之間時，三菌株混合菌對80 mg/L毒死蜱的降解率仍較高，最高達61％。
　　 5.以從蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HY-1菌株中提取到的降解酶比活力為指標，進行產酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化研究。通過單一因素試驗和正交試驗，對菌株HY-1的產酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。運用SPSS 1

13、3.0軟件進行結果分析，所獲優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：葡萄糖6.0 g/L、胰蛋白胨2.2 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 0.1 g/L和微量元素溶液2 mL/L。菌株發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化條件為：種子液培養(yǎng)時間16 h、發(fā)酵培養(yǎng)時間18 h、接種量1％（V/V）、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7.0。在NaCl 濃度為0?30 g/L 時，所產降解酶比活力不受影響。這是已報道

14、的耐鹽性最強的一株毒死蜱降解菌。
　　 6.為明確毒死蜱降解菌-蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HY-1的粗酶液對毒死蜱的降解特性，采用測定粗酶比活力的方法，研究了不同環(huán)境因素對粗酶液降解毒死蜱的影響。結果表明：粗酶液中可溶性蛋白的含量為2.21 g/L，測得粗提酶其米氏常數(shù)Km 為1.2356 mmol/L，最大降解速率VmaX為0.0226 μmol/（mg·min）。酶促反應時間為1 h 時，粗酶液對50 m

15、g/L 毒死蜱的降解率最高可達74％，粗酶液加入量為1 mL 時的比活力最高。在20℃?44℃的溫度范圍內，粗酶液都能保持較好的降解活性，其中最適溫度為28 ℃；在pH5?9之間時，粗酶比活力都能達最高比活力的66％以上，最適pH為6。
　　 進一步研究發(fā)現(xiàn)，該粗提酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在溫度為-20℃?40 ℃，pH為4?8的條件下，暴露1 h 仍能保持較高的比活力。該粗酶液在10?70 g/L的NaCl濃度下保持

16、1 h 仍能高效降解毒死蜱。該降解粗酶與國內外已報道的毒死蜱降解粗酶相比，其耐鹽性是最高的，故進一步開發(fā)應用價值較大。
　　 7.以海藻酸鈉為載體，采用注射器滴定方法將蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HY-1用海藻酸鈉溶膠包埋，研究固定化菌對毒死蜱的降解效果。結果表明：海藻酸鈉固定化菌能高效降解基礎培養(yǎng)基中100 mg/L的毒死蜱。當培養(yǎng)時間為60 h時，固定化菌對100mg/L毒死蜱的降解率最大。固定化菌顆粒接入