蘇云金桿菌aiiA基因的克隆及其表達(dá)產(chǎn)物抗細(xì)菌性病害研究.pdf

1、植物致病性病原菌最主要為革蘭氏陰性細(xì)菌，其自身代謝產(chǎn)物N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones，AHL)，是一類革蘭氏陰性細(xì)菌群體致病性應(yīng)答系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子。當(dāng)菌群中AHL累計(jì)到一定濃度后，就能激活病原菌致病基因表達(dá)，產(chǎn)生致病性并出現(xiàn)各種相關(guān)的病癥。因此降低病原菌AHL的濃度將成為防治這些病害的關(guān)鍵。目前已從芽胞桿菌等克隆出aiiA基因，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)的產(chǎn)物可以降解AHL，從而大大減弱致病菌的危害。

2、 本研究克隆了來(lái)自苔蘚、土壤和植物葉片中分離的蘇云金芽胞桿菌中aiiA基因，即aiiA-B15、aiiA-B19、aiiA-S2、aiiA-S9、aiiA-P4、aiiA-P28，并對(duì)其編碼的AHL-Lactonase蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明這些蛋白均為弱親水性蛋白，含有3個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域，均屬于β-內(nèi)酰胺酶超家族的結(jié)構(gòu)域。從計(jì)算機(jī)模擬的三級(jí)結(jié)構(gòu)可以看出，AHL-Lactonase蛋白中的His-104、His-106

3、、Asp-108、His-109、His-169、Asp-191、Tyr-194、His-235在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，形成一個(gè)較為致密的與甘油結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，是重要的活性中心。6個(gè)α螺旋位于外側(cè)，形成活性中心的表面保護(hù)層。通過(guò)比較16S rRNA基因和AHL-Lactonase蛋白的進(jìn)化樹(shù)，表明aiiA基因編碼的AHL-Lactonase蛋白與Bt物種的進(jìn)化并不同步，在該物種的進(jìn)化過(guò)程中aiiA基因可能早于物種的分化；aiiA基因不能作為

4、Bt物種進(jìn)化的遺傳標(biāo)記。這些預(yù)測(cè)結(jié)果的綜合應(yīng)用不僅為aiiA基因表達(dá)、蛋白純化等后續(xù)研究提供了大量寶貴的信息，并為改造AHL-Lactonase酶學(xué)特性，提高AHL-Lactonase的抗病能力等工作提供有價(jià)值的參考。 本研究首先選用了pGEX-4T-3表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEXaiiA-B15，獲得BL21(DE3)-pGEXaiiA-B15工程菌。表達(dá)條件的優(yōu)化表明，在0.6 mmol/L IPTG、30℃下誘導(dǎo)3h，蛋

5、白的表達(dá)量最大，但絕大多數(shù)為包涵體。接著利用pET-29a構(gòu)建了pET29a-aiiA融合表達(dá)載體，制備E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA工程菌，在0.8 mmol/L IPTG、20℃，25 h下誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了54.4μg/mL可溶性AHL-lactonase-B15蛋白，并采用親和層析的方法純化AHL-lactonase-B15。AHL-lactonase-B15對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌抗病性實(shí)驗(yàn)表明，AHL-

6、lactonase-B15具有較好的抗病性，明顯抑制了馬鈴薯的腐爛。值得注意的是，BL21(DE3)-pET29a-aiiA工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破壁的上清液樣品也具有很好的水解AHL的活性和抗病性。這表明AHL-lactonase-B15在濃度較低并存在很多雜蛋白的情況下仍然有較強(qiáng)的活性。這也提示了AHL-lactonase-B15具備作為新型高效無(wú)公害的生物農(nóng)藥的潛能，具有進(jìn)一步深入研究?jī)r(jià)值。AHL-lactonase-B15酶學(xué)特性