沙門菌invA基因的克隆、表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的初步研究.pdf

1、目的： 通過擴(kuò)增沙門菌invA基因，構(gòu)建pET-invA重組子，實現(xiàn)沙門菌invA基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬離子親和層析純化后，免疫CDl小鼠和新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體，并對免疫血清的性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為后續(xù)研究該蛋白的特性和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 本研究分為三部分： 1．沙門菌invA基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)invA基因序列設(shè)計引物，用PCR方法自沙門菌基因組中擴(kuò)增invA基

2、因目的片段。將該基因與原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET-30c(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-invA，并轉(zhuǎn)化克隆宿主菌E.coli DH5a，利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆，質(zhì)粒小量提取后，用雙酶切和基因序列測定鑒定重組質(zhì)粒。 2．沙門菌InvA融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定：第一部分所得重組質(zhì)粒pET-invA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coil BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況；通過鎳金屬離子親和層

3、析對InvA融合蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測蛋白純度和分子量，用anti-His-tag單克隆抗體以Western blotting鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的重組InvA蛋白。 3．InvA融合蛋白的免疫原性研究：使用考馬斯亮蘭法總蛋白定量測試盒對所得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行含量測定后，用來免疫CDl小鼠和新西蘭大白兔，間接ELISA法測定多克隆抗體的效價，并通過玻片凝集試驗觀察所制備的抗體與沙門菌的特異性凝集反應(yīng)。收集的血清在0.02％NA

4、N<,3>中-70℃保存。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建沙門菌invA基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-invA。此質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到表達(dá)載體片段(5.4kb)和目的基因片段(1.119kb)；經(jīng)測序，目的基因全長1119bp，與GenBank中所公布的序列相比較，存在9個堿基的差異，同源性大于99％；編碼含372個氨基酸殘基的多肽鏈。 2．經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，含重組質(zhì)粒pET-invA的表達(dá)宿主菌E．coli BL21(DE

5、3)在SDS-PAGE上大約48kD處有明顯的表達(dá)條帶，與核酸序列測定所推導(dǎo)的InvA融合蛋白分子量相符。在變性條件下，重組蛋白通過鎳金屬離子親和層析進(jìn)行純化，得到了電泳純的lava融合蛋白，純化產(chǎn)物能與anti-His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，證實為InvA融合蛋白。 3．純化產(chǎn)物經(jīng)測定，其蛋白濃度達(dá)到1mg／ml。用純化產(chǎn)物免疫CDl小鼠及新西蘭大白兔可以得到多克隆免疫血清，經(jīng)間接ELISA測定，兩種動物源性的抗體效

6、價均大于1：400,000，所制備的抗體經(jīng)玻片凝集試驗鑒定，可與沙門菌發(fā)生凝集反應(yīng)。 結(jié)論： 本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-invA，實現(xiàn)了沙門菌侵襲蛋白A基因在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，通過變性條件下的鎳金屬離子親和層析，獲得純度較高的InvA融合蛋白，純化的表達(dá)產(chǎn)物能刺激CDl小鼠和新西蘭大白兔產(chǎn)生特異性抗體，抗體效價均大于1：400,000，并能與沙門菌發(fā)生凝集，具有良好的免疫原性，為后續(xù)對該蛋白相關(guān)性質(zhì)的研