熒光分子探針技術(shù)在基因表達產(chǎn)物研究中的應(yīng)用.pdf

1、現(xiàn)代科學(xué)認為：許多疾病的發(fā)生與細胞內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)和表達水平變化有著直接的聯(lián)系。但是，如何借助有效的研究手段，從分子水平上實時、靈敏、特異地獲取這些信息變化，尤其是基因表達信息的變化，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究所面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，同時也為分析化學(xué)加強與醫(yī)學(xué)的融合提供了新的機遇。熒光分子探針技術(shù)作為一種靈敏、準確的研究手段和方法，結(jié)合生物大分子的一些特殊生化性質(zhì)，如核酸雜交、核酸-蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)(酶)對底物的特異性識別和切割等，將生物分子信息轉(zhuǎn)

2、變?yōu)橐子跈z測的熒光信號，有望在獲取基因表達產(chǎn)物信息方面取得突破。但是，由于受到熒光分子探針類型的限制和基因表達產(chǎn)物多樣性的影響，目前基于熒光分子探針檢測基因表達產(chǎn)物的方法還不多。因此，進一步發(fā)展可用于檢測基因表達產(chǎn)物的熒光分子探針新方法、新技術(shù)和新原理是一項非常有意義的前瞻性研究工作。 本論文以細胞中能降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險的一類基因表達產(chǎn)物損傷修復(fù)蛋白為研究對象，利用這些蛋白的催化功能，結(jié)合研制新型熒光分子探針，從檢測尿嘧啶糖苷酶(

3、UDG)著手，以發(fā)展操作簡單快速、靈敏度高、選擇性好、而且樣品量小的新方法為研究主線，利用新的雙鏈熒光探針建立了損傷修復(fù)蛋白UDG、APE1和T4DNA連接酶的活性分析新方法，利用已有的分子信標探針開展了損傷修復(fù)蛋白hOGG1活性分析；同時利用分子信標開展了基因表達產(chǎn)物mRNA的定量檢測研究。這種用于基因表達產(chǎn)物研究的熒光分子探針技術(shù)具有操作簡單、快速、可實時監(jiān)測等優(yōu)點，一定程度上克服了基于放射性標記、凝膠電泳等經(jīng)典分析方法費時、費力以

4、及無法實時獲取基因表達產(chǎn)物信息的缺陷。論文主要內(nèi)容歸納如下： 第一部分熒光分子探針用于基因表達產(chǎn)物堿基損傷修復(fù)蛋白的檢測1、利用雙鏈熒光探針建立了簡單快速的UDG酶活性分析的新方法。UDG酶是一種能特異消除損傷堿基尿嘧啶的蛋白，在防止基因突變，調(diào)節(jié)免疫功能等方面具有重要意義。目前采用的放射性標記和電泳分析UDG酶活性的方法，不利于酶促反應(yīng)過程實時監(jiān)測和活性分析。本章設(shè)計雙鏈熒光探針作為切割底物和檢測分子，通過監(jiān)測尿嘧啶切割過程中

5、溶液熒光信號的變化，建立了UDG酶高靈敏分析方法，檢測下限可達0.033U/mL：考察了反應(yīng)溶液中金屬離子、化學(xué)藥物以及底物濃度等條件變化對切割反應(yīng)初速度的影響，開展了UDG酶促反應(yīng)機制和動力學(xué)過程研究；這種新方法還可快速、準確檢測腫瘤細胞中UDG酶活性，檢測靈敏度與放射性同位素法相當(dāng)。以上結(jié)果不僅證明熒光分子探針技術(shù)用于堿基損傷修復(fù)蛋白活性檢測的可行性，而且有望為臨床診斷提供新的輔助手段。 2、利用雙鏈熒光探針建立了簡單、快速

6、的APE1酶活性分析的新方法。APE1是細胞中水解AP位點的糖苷酶，主要參與堿基損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡等生命過程。為了避免傳統(tǒng)的APE1酶活性分析方法操作復(fù)雜、費時的缺陷，我們以含有AP位點的雙鏈熒光探針作為反應(yīng)底物，在均相溶液中實時監(jiān)測AP位點水解反應(yīng)過程，建立了一種APE1酶活性分析的新方法，其線性檢測范圍為0.024-2U/mL，檢測下限為0.024U/mL；通過考察和優(yōu)化溶液的金屬離子、化學(xué)藥物以及底物濃度等實驗條件，

7、在均相溶液中實現(xiàn)了酶促反應(yīng)機制和動力學(xué)過程研究；這種新方法還可用于腫瘤細胞中APE1活性水平的檢測，與其他方法相比，該方法不僅靈敏度達到放射性同位素法的水平，而且特異性強、檢測結(jié)果準確，有望在腫瘤早期診斷上發(fā)揮重要作用。 3、利用雙鏈熒光探針建立了DNA連接酶活性分析的新方法。核酸連接是生命科學(xué)中倍受關(guān)注的生命活動。其活性分析和機理研究有助于進一步拓展核酸連接反應(yīng)在疾病檢測、基因載體及核酸修飾與分析等方面的應(yīng)用。利用雙鏈分子探針作為核酸

8、連接的模板和信號分子，通過實時監(jiān)測熒光信號降低來監(jiān)測T4DNA連接酶反應(yīng)過程，為連接酶活性分析、連接機理及其動力學(xué)過程研究提供了一種簡便快捷的方法。 4、利用單鏈探針分子信標建立了簡單、快速的hOGG1酶活性分析的新方法。根據(jù)hOGG1酶能切割損傷堿基8-oxoG和裂解DNA鏈雙重功能的特性，將8-oxoG設(shè)計在分子信標莖部，發(fā)展了一種可作為hOGG1酶底物的新型熒光探針。通過實時監(jiān)測hOGG1酶識別切割8-oxoG后引起的溶液

9、熒光信號變化，建立了一種分析hOGG1酶活性的新方法，檢測線性范圍為0.0125-5U/mL，檢測下限為0.0125U/mL；通過考察和優(yōu)化反應(yīng)溶液中金屬離子、化學(xué)藥物以等實驗條件，開展了hOGG1酶促反應(yīng)機制和動力學(xué)過程研究；這種新的熒光分析方法用于多種腫瘤細胞hOGG1活性水平準確檢測的結(jié)果表明：這種新方法可望為臨床腫瘤早期診斷提供輔助手段。 第二部分熒光分子探針用于基因表達產(chǎn)物mRNA的檢測5、利用分子信標體外定量檢測腫瘤

10、抑制基因ING1 mRNA的表達?；谀[瘤抑制基因ING1 mRNA的序列保守區(qū)設(shè)計合成分子信標，將其與體外轉(zhuǎn)錄的ING1RNA雜交，得到了ING1分子信標/RNA雜交標準曲線；通過考察雜交緩沖溶液的離子強度、pH值以及其他核酸分子對分子信標與細胞mRNA雜交過程的影響和體系優(yōu)化，在均相溶液中實現(xiàn)了ING1 mRNA表達水平的定量檢測，并利用RT-PCR法驗證了檢測結(jié)果。與其他mRNA檢測方法相比，該方法簡單、快速，而且檢測過程不經(jīng)過擴