熒光探針熔解曲線技術(shù)在病毒診斷中的應(yīng)用.pdf

1、病毒的感染是人類多種疾病的起因，病毒的診斷對(duì)這些疾病的預(yù)防與治療具有重要意義。本論文圍繞熒光探針熔解曲線技術(shù)在病毒診斷中的應(yīng)用展開(kāi)了研究。以熒光探針熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)，我們建立了多重點(diǎn)突變檢測(cè)，多重靶序列識(shí)別和二維標(biāo)記PCR三個(gè)中通量的致病性病毒檢測(cè)體系。本論文選擇乙型肝炎病毒(HBV)和人乳頭瘤病毒(HPV)兩種具有代表性的病毒作為研究模型建立檢測(cè)體系并進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。
　　 第一章為緒論，首先簡(jiǎn)要地介紹了病毒檢測(cè)技術(shù)的概況，然

2、后總結(jié)了熒光探針熔解曲線技術(shù)的主要特點(diǎn)以及目前適用于熔解曲線分析的熒光探針類型，最后提出本論文的設(shè)計(jì)思路和研究意義。
　　 第二章設(shè)計(jì)了一個(gè)基于熒光探針熔解曲線技術(shù)的多重點(diǎn)突變檢測(cè)體系。這一體系將覆蓋不同檢測(cè)區(qū)域的多色熒光探針進(jìn)行組合，達(dá)到了提高檢測(cè)通量的目的。在本章節(jié)中我們根據(jù)臨床需求建立了單管三色和兩管四色兩種HBV耐藥突變檢測(cè)方案。單管三色檢測(cè)方案可以同時(shí)識(shí)別HBV最常見(jiàn)的4個(gè)耐藥位點(diǎn)上的6種耐藥突變，用于拉米夫定和阿德福

3、韋酯兩種常用核苷類似物的耐藥突變檢測(cè)。兩管四色檢測(cè)方案可以同時(shí)識(shí)別HBV的11個(gè)耐藥位點(diǎn)的27種耐藥突變，用于FDA認(rèn)證的五種核苷類似物的耐藥突變檢測(cè)。最后我們用117HBV陽(yáng)性的血清標(biāo)本對(duì)單管三色HBV耐藥檢測(cè)體系進(jìn)行了臨床評(píng)價(jià)。
　　 第三章提出了一種能夠同時(shí)檢測(cè)、識(shí)別并且定量多重目標(biāo)序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)。這一技術(shù)將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和熒光探針熔解曲線技術(shù)相結(jié)合，在保持實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上有效地提高了檢測(cè)通量

4、。在本章節(jié)中我們實(shí)現(xiàn)了在三個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)、分型并定量30種常見(jiàn)的HPV基因型和內(nèi)標(biāo)人球蛋白基因。最后我們用647份宮頸棉拭子標(biāo)本對(duì)實(shí)時(shí)PCR-熔解曲線HPV檢測(cè)體系進(jìn)行了臨床評(píng)價(jià)。
　　 第四章開(kāi)發(fā)了一個(gè)由熒光波長(zhǎng)和熔點(diǎn)溫度兩個(gè)參數(shù)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行二維標(biāo)記的中通量檢測(cè)平臺(tái)。這一平臺(tái)融合了連接酶檢測(cè)反應(yīng)，PCR擴(kuò)增和熒光探針熔解曲線三個(gè)技術(shù)，大幅度地減少了識(shí)別多個(gè)目標(biāo)序列所需的熒光探針數(shù)量。在本章節(jié)中我們實(shí)現(xiàn)了在只使用4條熒光探