熔解曲線分析技術(shù)用于基因型的研究.pdf

1、熔解曲線分析法(Melting curve analysis)是一種PCR后產(chǎn)物分析技術(shù)，具有操作簡單、結(jié)果判斷直觀等特點，已經(jīng)被廣泛用于突變掃描、甲基化檢測等研究。熔解曲線分析技術(shù)可分為探針熔解曲線(Probe melting curve)和熒光染料熔解曲線(Fluorescent dye melting curve)兩大類。探針熔解曲線利用探針與不同的靶序列雜交后形成的雙鏈DNA熔點(Melting temperature，Tm)的

2、差異來區(qū)分不同的靶序列，是實現(xiàn)多重實時檢測的重要途徑之一。但難點在于探針設(shè)計和如何使一條探針能同時高效率結(jié)合多種靶序列，并且具有多個可區(qū)分的熔點峰；熒光染料熔解曲線無需探針設(shè)計，簡單且成本低，但由于熒光染料是通用的雙鏈DNA嵌入劑，對引物二聚體(Primer-dimers)和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物(Non-specificamplification products)無法識別，容易造成假陽性。本論文針對兩種熔解曲線分析法存在的問題進(jìn)行了理論研究

3、并加以改進(jìn)，并以人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)基因分型為例，探討改進(jìn)后熔解曲線分析法在基因分型上的應(yīng)用。
　　 第一章，針對以上多重探針熔解曲線的問題，設(shè)計兩條不同長度的探針和一系列靶序列。探討探針長度、錯配位置、與探針臂部結(jié)合的堿基數(shù)目和靶序列濃度對探針結(jié)合效率和熔點峰的影響。最后，總結(jié)相關(guān)的設(shè)計技巧，為多重探針熔解曲線體系的建立提供重要的參考依據(jù)。
　　 第二章，基于目前人乳頭瘤病毒基

4、因分型方法的優(yōu)缺點，擬以2種常見的HPV(16和18)分型為切入點，建立一種用于HPV基因分型的雙重實時PCR熔解曲線法。引物設(shè)計基于擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification refractory mutationsystem，ARMS)引物設(shè)計原理，用以提高引物的特異性。實時PCR法結(jié)合熔解曲線法，具有高靈敏度、高特異性的特點，且操作簡單、成本低廉，是一種易于在臨床診斷推廣應(yīng)用的HPV基因分型方法。
　　 最后本文附錄了兩