院內(nèi)感染細菌16S rDNA基因分型高分辨熔解曲線方法的建立.pdf

1、目的：建立院內(nèi)感染常見9種細菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌16S rDNA基因的聚合酶鏈式反應-高分辨率熔解曲線（PCR-HRM）的分子分型方法，并收集包含在上述9種菌內(nèi)的25株院內(nèi)感染細菌臨床分離株進行PCR-HRM方法臨床驗證。
　　方法：從文獻中檢索16S rDNA基因V1、V3、V6、V9高變區(qū)引物，收集9種院感細菌的標準株，使用上述引物

2、擴增這9種菌對引物進行驗證；擴增V3-V6區(qū)測序，測序結(jié)果上傳Genbank進行同源性比對和分析，確定本實驗所用的標準菌型別與Genbank中所報道的細菌種屬一致；對9種院感細菌標準株的16S rDNA基因V1、V3、V6、V9可變區(qū)進行PCR-HRM，并根據(jù)以上各可變區(qū)的HRM熔解曲線形狀和Tm值差異建立亞組分析決定樹方法，分步對院內(nèi)感染常見的9種細菌鑒別；收集已確定為院內(nèi)感染細菌并包含在上述9種菌的臨床分離株25株，使用本實驗建立的

3、亞組分析決定樹方法進行盲法鑒定，鑒定結(jié)果與微生物表型鑒定結(jié)果進行比較。
　　結(jié)果：（1）可使用V3、V6、V9區(qū)引物擴增9種菌的目的產(chǎn)物，V1區(qū)引物只能用于擴增4種革蘭陽性菌（表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌）；本實驗所用的菌株與Genbank中其相應模式菌的相似性為99％-100%，可認為所選用菌株的種屬無誤。（2）根據(jù)9種院感細菌標準株的16S rDNA基因V1、V3、V6、V9可變區(qū)的PCR-HRM結(jié)果，建立

4、了亞組分析決定樹方法：①在V1區(qū)鑒別革蘭氏陽性菌和陰性菌：4種革蘭氏陽性菌在V1區(qū)有目的產(chǎn)物，5種革蘭氏陰性菌無目的產(chǎn)物；②4種革蘭陽性菌鑒別：在V9區(qū)鑒別葡萄球菌（表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌）和腸球菌（糞腸球菌和屎腸球菌）：葡萄球菌和腸球菌在V9區(qū)按Tm值不同分成兩群（葡萄球菌平均Tm=88.20℃；腸球菌平均Tm=89.75℃）；在V3區(qū)鑒別兩種葡萄球菌：兩種葡萄球菌在V3區(qū)熔解曲線形狀不同；在V1區(qū)鑒別兩種腸球菌：兩種腸球菌在V

5、1區(qū)內(nèi)Tm值相差較大（屎腸球菌Tm=85.74℃；糞腸球菌Tm=86.94℃）；③5種革蘭氏陰性菌鑒別：5種菌在V3區(qū)按照熔解曲線形狀和Tm值的差異分成3群，包括1群（肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌），2群（陰溝腸桿菌和大腸埃希菌），3群（銅綠假單胞菌）；3群的熔解曲線為雙峰，且Tm值較高，可在V3區(qū)直接區(qū)分；在V6區(qū)鑒別1群細菌：兩種菌在V6區(qū)Tm值差異明顯（肺炎克雷伯菌Tm=86.20℃；鮑曼不動桿菌Tm=84.84℃）；混熔鑒別2群細

6、菌：2群細菌在4個可變區(qū)的Tm值和曲線形狀差異均不明顯，因此設置大腸埃希菌為參考菌株，選擇V6區(qū)為擴增區(qū)，與陰溝腸桿菌V6區(qū)擴增產(chǎn)物混熔，結(jié)果顯示為雙峰。（3）25株臨床分離株的驗證結(jié)果顯示，22株細菌的HRM鑒定結(jié)果與微生物表型鑒定結(jié)果一致，1株鑒定結(jié)果不一致（HRM鑒定為金黃色葡萄球菌，微生物表型鑒定結(jié)果為表皮葡萄球菌），2株無法使用亞組分析決定樹分組。
　　結(jié)論：利用PCR-HRM技術建立了院內(nèi)感染常見9種細菌鑒定的亞組分析