高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(HRM)系統(tǒng)的建立及其在基因多態(tài)性和突變檢測方面的應(yīng)用.pdf

1、高分辨率熔解曲線分析技術(shù)自從2003年被開發(fā)以來，因其具有明顯優(yōu)點而被迅速的應(yīng)用到各個領(lǐng)域的研究中。HRM通過飽和染料對PCR產(chǎn)物的熔解曲線變化進(jìn)行實時監(jiān)測，不需要使用針對目標(biāo)位點的特異性等位引物或探針，只需一對引物就可以對等位基因的變化進(jìn)行識別。其靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單快速、高效、經(jīng)濟(jì)，同時HRM檢測不受堿基位點的局限，還具有高通量、閉管操作等優(yōu)點[1]，非常經(jīng)濟(jì)有效。本文首先通過檢測ALDH2多態(tài)性建立快速高效的HRM檢測系統(tǒng)，然

2、后利用HRM對新生兒缺陷相關(guān)基因MTHFR和MTRR基因多態(tài)性位點進(jìn)行檢測，證明HRM可很好的應(yīng)用于臨床單基因遺傳病的檢測，快速準(zhǔn)確。同時，我們還試著利用HRM對激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)切割基因產(chǎn)生突變的效率進(jìn)行檢測，結(jié)果也表明HRM可用于對大樣本的未知突變位點的突變效率進(jìn)行檢測。HRM是快速、有效、經(jīng)濟(jì)、方便的檢測單基因疾病以及突變的方法。
　　第一部分通過檢測乙醛脫氫酶(ALDH2)基因多態(tài)性建立HRM的檢測系統(tǒng)

3、r>　　目的：探索DNA濃度以及純度對HRM靈敏性與準(zhǔn)確度的影響，建立多態(tài)性位點的HRM檢測體系。方法：收集正常血樣，抽取血液DNA并定量。設(shè)計ALDH2基因的rs671特異性HRM引物，采用直接測序法以及HRM對其進(jìn)行檢測，并比較檢測結(jié)果。結(jié)果：經(jīng)HRM法，96例未知基因型的樣本中，檢測出67例野生型ADLH2*1/1(G/G)，26例雜合型ADLH2*1/2(G/A)，3例突變型ADLH2*2/2(A/A)，與測序結(jié)果一致。結(jié)論：H

4、RM分析法是一種具有簡單、快速，經(jīng)濟(jì)、高效以及高通量等優(yōu)點的遺傳學(xué)分析方法，可以用于對ALDH2基因突變進(jìn)行快速檢測，同時，可以應(yīng)用到其他基因多態(tài)性的檢測。
　　第二部分應(yīng)用HRM檢測新生兒出生缺陷相關(guān)基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTH FR）和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因多態(tài)性
　　目的：利用HRM對MTHFR的兩個SNP位點和MTRR的一個SNP位點分別進(jìn)行檢測，探討HRM對SNP檢測的準(zhǔn)確性，為臨床上新生兒出生缺

5、陷相關(guān)基因多態(tài)性的快速檢測與治療提供參考。方法：收集正常血樣，抽取血液DNA并定量。設(shè)計MTHFR兩個SNP位點c.677 C＞T和c.1298 A＞C和MTRR的一個SNP位點c.66 A＞G的特異性HRM引物，利用HRM法對其進(jìn)行檢測，然后取部分樣本測序，比較檢測結(jié)果。結(jié)果：經(jīng)HRM法，96例未知基因型的樣本中，MTHFRc.677 C＞T位點檢測61例為C/C型，31例為C/T型，4例為T/T型;MTHFR c.1298A＞C位點

6、檢測出50例為A/A型，30例為A/C型，16例為C/C型;對MTRR c.66A＞G位點檢測出51例為A/A型，40例為A/G型，均與測序結(jié)果一致。結(jié)論：HRM可快速準(zhǔn)確地檢測新生兒出生缺陷相關(guān)基因多態(tài)性，是一種高效的可應(yīng)用于臨床的檢測方法。
　　第三部分應(yīng)用HRM檢測TALEN切割基因產(chǎn)生變異的效率
　　目的：探討通過HRM對未知基因突變位點進(jìn)行檢測的可行性，為基因突變模型構(gòu)建的檢測建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測平臺。方法：

7、構(gòu)建特異性敲除MSTN基因的TALEN質(zhì)粒，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗、小鼠尾靜脈快沖實驗以及小鼠受精卵微注射實驗得到相應(yīng)的基因敲除DNA，然后設(shè)計特異性引物進(jìn)行HRM檢測，同時對相應(yīng)樣本進(jìn)行測序，將HRM與直接測序結(jié)果相比較。結(jié)果：HRM法檢測DNA突變分型結(jié)果為:7個孔的293T細(xì)胞DNA樣本分型為三組，實驗組與對照組明顯分開，實驗組中也有不同變異顯示的不同分型;10例小鼠肝臟DNA樣本HRM分型為三組，1號為一組，2、3號為一組，剩余對照分