DNA條形碼及高分辨率熔解曲線在種子類和谷物芽類藥材鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、種子是大部分藥用植物的主要繁殖器官，也是中藥材一個(gè)重要的組成部分，在中醫(yī)防治疾病的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。種子類藥材因其體積小、肉眼難以分辨，市場(chǎng)上摻偽和來(lái)源不明等問題時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響臨床用藥安全和療效發(fā)揮；谷物芽類藥材在防治疾病方面具有一定功效，各谷物芽類藥材功效各有側(cè)重，且常與混偽品相互混淆，為解決這些問題，亟需尋找能夠快速準(zhǔn)確鑒定種子類和谷物芽類藥材的新方法。近年來(lái)，中草藥DNA條形碼生物鑒定體系已初步建立，對(duì)中藥材及藥用植物的鑒

2、定具有重要理論指導(dǎo)和應(yīng)用價(jià)值，對(duì)解決我國(guó)生藥鑒定的重大科技難題具有重大意義。本文以2015年版《中國(guó)藥典》收載的51種種子藥材的64種基原植物和3種谷物芽類藥材的3個(gè)基原植物為主要研究對(duì)象，以ITS2序列為主，psbA-trnH序列為輔對(duì)種子類和谷物芽類藥材進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定，并用于市場(chǎng)流通中的種子類藥材檢驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)對(duì)種子類藥材摻偽鑒定進(jìn)行探索研究。
　　1.采用試劑盒法提取種子類藥材的基原植

3、物總DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增其 ITS2序列或 psbA-trnH序列并雙向測(cè)序。應(yīng)用 CodonCode Aligner v4.2.5對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)獲得ITS2序列或psbA-trnH序列，并通過(guò)建立的中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)市場(chǎng)種子類藥材進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示大部分種子類藥材為正品，小部分為各自的混偽品，本研究為保證種子類藥材臨床準(zhǔn)確安全用藥提供依據(jù)。
　　2.采用試劑盒法提取谷物芽類藥材的基原植物

4、及其混偽品總DNA，通過(guò) PCR擴(kuò)增其 ITS2序列并雙向測(cè)序。應(yīng)用 CodonCode Aligner v4.2.5對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)獲得ITS2序列，用MEGA6.0軟件對(duì)所有10個(gè)物種74條序列計(jì)算種內(nèi)和種間K2P（Kimura2-parameter）遺傳距離，分析變異位點(diǎn)并構(gòu)建系統(tǒng)鄰接（Neighbour-Joining tree,NJ）樹。結(jié)果表明稻芽、谷芽和麥芽的基原植物稻、粟和大麥的種內(nèi)最大 K

5、2P遺傳距離均遠(yuǎn)小于其與混偽品之間的種間最小K2P遺傳距離；NJ樹結(jié)果顯示稻、粟和大麥各自聚為一支，均與混偽品明顯區(qū)分開，各混偽品物種也單獨(dú)聚為一支，本研究為保障谷物芽類藥材臨床準(zhǔn)確用藥提供了新的技術(shù)手段。
　　3.采用 DNA條形碼與高分辨率熔解曲線技術(shù)結(jié)合對(duì)天仙子及其混偽品、桃仁和苦杏仁鑒定，并對(duì)其摻雜最低檢測(cè)限進(jìn)行探索，結(jié)果表明天仙子與其混偽品能夠很好的區(qū)分。對(duì)天仙子與沙苑子的DNA混合、苦杏仁與桃仁的種子混合檢測(cè)，結(jié)果顯示