突變富集高分辨率熔解曲線分析技術(shù)體系的建立以及在循環(huán)外周血檢測(cè)中的運(yùn)用.pdf

1、許多研究已經(jīng)證實(shí)，腫瘤患者循環(huán)外周血DNA與腫瘤組織DNA的突變具有一致性，又因?yàn)檠簶颖玖羧》奖?，可隨時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，因此循環(huán)外周血成為腫瘤突變檢測(cè)較佳的替代的樣本，而在循環(huán)外周血中實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)也越來(lái)越成為技術(shù)研發(fā)人員所關(guān)注的熱點(diǎn)。許多針對(duì)外周血檢測(cè)的方法應(yīng)運(yùn)而生，但實(shí)際檢測(cè)結(jié)果卻差強(qiáng)人意。循環(huán)血中DNA總量偏低，且存在大量正常組織DNA的混雜，個(gè)體差異、腫瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)期、治療時(shí)期造成循環(huán)DNA的總量不定使得檢測(cè)循環(huán)外周血基

2、因的技術(shù)手段要求不需要依賴(lài)DNA濃度的判斷，無(wú)需聚類(lèi)對(duì)比，具備高特異性以及超高的檢測(cè)靈敏度。現(xiàn)階段還沒(méi)有一種商業(yè)化的快速、簡(jiǎn)便的高靈敏度檢測(cè)方案能夠擺脫以上檢測(cè)條件的限制，實(shí)現(xiàn)在外周血腫瘤標(biāo)志基因的檢測(cè)，這方面的研究工作還需要進(jìn)一步探索。
　　高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high resolution melting analysis，HRM)利用不同長(zhǎng)度或不同堿基組成的DNA序列熔解曲線不同的原理，在PCR后直接運(yùn)行高分辨熔解就可

3、完成對(duì)樣品突變分析。HRM技術(shù)作為一種閉管檢測(cè)、簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的一種分型篩查方式，在臨床推廣上有著無(wú)可比擬的優(yōu)越性。但是傳統(tǒng)的HRM技術(shù)除了其技術(shù)本身存在的缺陷，還存在著對(duì)操作均一性要求較高，檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性不高等問(wèn)題，這些使得HRM技術(shù)的運(yùn)用推廣受到很大的限制。本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用更高精度的HRM技術(shù)，并增加其靈敏度，降低判別難度，使其在臨床運(yùn)用上得到更好的運(yùn)用。
　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)明了一種新的富

4、集擴(kuò)增的技術(shù)—Snapback primer ARMS（SP-ARMS），獲得了近1000倍的富集效率，并將此新的高效富集擴(kuò)增技術(shù)與HRM技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了萬(wàn)分之一甚至更高的檢測(cè)靈敏度，滿足了臨床上對(duì)突變檢測(cè)技術(shù)不易污染、靈敏性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便易行、結(jié)果易判定的要求。隨后我們將此技術(shù)成功運(yùn)用于非小細(xì)胞肺癌患者組織和血漿樣本EGFR/KRAS基因檢測(cè)中，與組織測(cè)序和ADx-EGRR/KRAS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相比，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

5、
　　第一部分:彈回探針突變富集擴(kuò)增技術(shù)(Snapback primer ARMS，SP-ARMS)的發(fā)明和彈回探針突變富集擴(kuò)增高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(SPA-HRM)體系的建立
　　目的：發(fā)明彈回探針突變富集擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)突變型模板高效率的富集擴(kuò)增，達(dá)到對(duì)低頻體細(xì)胞突變基因的檢測(cè)的要求，且能與HRM技術(shù)進(jìn)行無(wú)間斷銜接，以實(shí)現(xiàn)一步化基因檢測(cè)。方法：通過(guò)檢測(cè)EGFR、KRAS基因突變建立彈回探針高分辨率熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)

6、體系，在47例具有測(cè)序結(jié)果的非小細(xì)胞肺癌患者組織中進(jìn)行檢測(cè)體系特異性的驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上發(fā)明彈回探針突變富集擴(kuò)增技術(shù)(SP-ARMS)，將突變型與野生型模板按照不同比例混合，經(jīng)過(guò)普通PCR和SP-ARMS技術(shù)的富集擴(kuò)增后，使用測(cè)序技術(shù)檢測(cè)該技術(shù)的富集效率。之后結(jié)合彈回探針HRM檢測(cè)，建立一步快速?gòu)椈靥结樛蛔兏患瘮U(kuò)增高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(SPA-HRM)體系，并檢測(cè)其靈敏度。結(jié)果：經(jīng)過(guò)組織測(cè)序鑒定，EGFR基因19號(hào)外顯子缺失突變經(jīng)SP

7、-ARMS技術(shù)的富集擴(kuò)增后，測(cè)序可以達(dá)到萬(wàn)分之一的靈敏度;L858R點(diǎn)突變和KRAS基因點(diǎn)突變經(jīng)SP-ARMS技術(shù)的富集擴(kuò)增后，可以檢測(cè)到百分之一的突變。SPA-HRM檢測(cè)系統(tǒng)在此基礎(chǔ)上又將靈敏度提高了10倍。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)明了一種富集擴(kuò)增的技術(shù)—Snapback primer ARMS，獲得了高達(dá)1000倍的富集效率，是一項(xiàng)高效、簡(jiǎn)單易行、不需要提高任何檢測(cè)成本的高效富集擴(kuò)增方法，隨之與Snapback primer HRM技術(shù)的結(jié)合

8、，實(shí)現(xiàn)了千分之一到萬(wàn)分之一甚至更高的檢測(cè)靈敏度。
　　第二部分:在組織、循環(huán)外周血中運(yùn)用彈回探針突變富集擴(kuò)增高分辨率熔解曲線分析技術(shù)進(jìn)行EGFR、KRAS基因突變的檢測(cè)
　　目的：在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者組織、循環(huán)外周血中運(yùn)用SPA-HRM技術(shù)進(jìn)行相關(guān)突變檢測(cè)，與組織測(cè)序、ADX-EGFR/KRAS基因檢測(cè)試劑盒相比，檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。方法：收集NSCLC患者肺癌組織樣本150例、其中有85例循環(huán)外周血樣本與之相對(duì)應(yīng)

9、。通過(guò)引物探針的設(shè)計(jì)進(jìn)行EGFR基因exon19缺失突變、exon21 L858R點(diǎn)突變和KRAS基因2號(hào)外顯子第12、13密碼子常見(jiàn)突變的檢測(cè)。進(jìn)行基因組DNA的抽提后，使用SPA-HRM技術(shù)檢測(cè)的同時(shí)，使用測(cè)序技術(shù)和ADX-EGFR、KRAS基因試劑盒進(jìn)行雙盲檢測(cè)，鑒定該檢測(cè)技術(shù)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性;探論血漿與血清樣本對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，選擇合適的樣本量和樣本抽提方式。結(jié)果：在85例的NSCLC患者血液樣本及相對(duì)應(yīng)的組織樣本檢測(cè)中，測(cè)序法