利用Faecalibacterium 16S rDNA基因標(biāo)記檢測(cè)環(huán)境水體中豬糞便污染的研究.pdf

1、隨著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，豬糞便污染問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重，這對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康都造成嚴(yán)重威脅。而傳統(tǒng)糞便指示菌大腸桿菌由于在自然環(huán)境中能夠生存且繁殖，因此無(wú)法準(zhǔn)確追蹤宿主糞便污染源。本研究通過(guò)采集126份動(dòng)物糞便樣品（包含雞，鴨，人，狗，豬，牛），應(yīng)用高能量測(cè)序技術(shù)研究了糞便微生物種類及其多樣性，選用微生物源示蹤技術(shù)（MST），以 Faecalibacterium菌為糞便污染指示菌，根據(jù)其16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物并篩選豬糞便污染物的特異性分

2、子標(biāo)記，以定量PCR方法對(duì)豬糞便污染源進(jìn)行檢測(cè)與追蹤。
　　高通量測(cè)序共獲取146,038條細(xì)菌16S rDNA序列。其中厚壁菌門(mén)在動(dòng)物糞便中豐度較高，約占39.10％-69.44%；其次為擬桿菌門(mén)（10.64%-48.41%）、變形菌門(mén)（0.060%-39.75%）。雞、鴨、牛、豬、人糞便微生物中平均Shannon指數(shù)分別為1.21、1.22、1.13、0.83與0.94；平均Simpson指數(shù)分別為0.65、0.63、0.60

3、、0.46與0.55。對(duì)不同物種糞便污染物Faecalibacterium菌16S rDNA基因序列的保守區(qū)和可變區(qū)進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)一對(duì)Faecalibacterium菌通用引物（FUP）以及兩對(duì)特異性引物（PFB-1和PFB-2）。PCR結(jié)果顯示FUP在所有糞便DNA樣品中均能擴(kuò)增出目的片段，片段大小為237 bp。PFB-1和PFB-2僅在豬混合糞便樣品中擴(kuò)增出目的片段，片段大小分別為172 bp和225 bp，兩對(duì)引物的特異性均達(dá)到

4、100%，與其他物種糞便污染物之間無(wú)交叉反應(yīng)；研究表明PFB-2陽(yáng)性率（90%）略高于PFB-1（86%），且PFB-2引物的最低檢測(cè)限（LOQs）（2.9拷貝數(shù)/100 ml）低于PFB-1（6.53拷貝數(shù)/100 ml）引物。由此可見(jiàn) PFB-2比PFB-1的靈敏度更高，更適合用來(lái)對(duì)水體中豬糞便污染進(jìn)行追蹤和檢測(cè)。此外，使用定量PCR考察了PFB-2在不同溫度和光照處理下的衰變特性，在15 ℃、黑暗條件下，衰變速率為0.0647 h

5、-1，持續(xù)時(shí)間為71.17 h；在25 ℃、光照條件下，衰變速率為k1=0.1112 h-1，持續(xù)時(shí)間為41.41 h，表明低溫和暗環(huán)境下分子標(biāo)記的衰變速率較慢。最后，隨機(jī)采集實(shí)際環(huán)境水樣，驗(yàn)證 PFB-2作為豬糞便污染標(biāo)記物的實(shí)際效果，在豬農(nóng)場(chǎng)附近采集的三份水樣中檢測(cè)到的濃度分別為8.4±0.7×104、4.5±0.5×103和3.6±1.2×102拷貝數(shù)/100 ml。而在其它地點(diǎn)采集的水樣中的檢測(cè)結(jié)果為陰性。本研究實(shí)現(xiàn)對(duì)近期豬糞便