16S rRNA-rDNA序列分析技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物群落的初步研究.pdf

1、微生物是廢水處理、城市生活垃圾填埋或堆肥處理等系統(tǒng)中的主要功能生物，充分認(rèn)識(shí)其中的微生物學(xué)原理能為改進(jìn)處理工藝、提高處理效率提供依據(jù)；此外，污染環(huán)境的土著微生物也是污染自凈的重要作用者，深入了解其存在狀況可以為這些污染環(huán)境的原位或異地恢復(fù)提供有力的微生物學(xué)根據(jù)。但是，目前研究環(huán)境微生物群落的主要方法仍是基于培養(yǎng)和分離純化的傳統(tǒng)技術(shù)，已經(jīng)無法滿足研究者對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析與鑒定的要求。利用基于16S rRNA/rDNA 序列分

2、析的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，研究者可以在不對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)的情況下對(duì)其進(jìn)行研究，甚至還可以利用原位核酸雜交和原位PCR 技術(shù)對(duì)特定環(huán)境中的微生物進(jìn)行原位分析鑒定，并對(duì)微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，結(jié)果快速、準(zhǔn)確。 本論文提出和改進(jìn)了溶菌酶法、超聲波破碎法和蛋白酶K-CTAB法等3種方法從環(huán)境樣品（本論文中以復(fù)雜的堆肥為例）直接提取微生物DNA，細(xì)胞直接計(jì)數(shù)表明三種方法對(duì)細(xì)胞的破碎效率均達(dá)到了94％以上，分光光度法檢測表明純化后的D

3、NA中腐殖酸濃度低于20 ng/μl，A260/280值為1.7～1.8，使用16S rDNA引物對(duì)27F/1495R 和GC341F/907R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到了特異性很強(qiáng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行的限制性片段長度多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電泳分析都表明，3種方法提取的DNA中有一致的微生物遺傳多樣性，因而能夠應(yīng)用于環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)研究。 為了初步了解堆肥中的細(xì)菌群落及其動(dòng)態(tài)變化情況，使用餐廚垃圾進(jìn)行為期18天的小

4、規(guī)模堆肥，高溫階段（溫度高于50℃）共7天，最高溫度達(dá)到65℃，使用蛋白酶K-CTAB法從偶數(shù)天和高溫階段堆肥樣品中提取總DNA，并使用16S rDNA引物對(duì)GC341F/907R進(jìn)行PCR-DGGE 分析，結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析、條帶測序和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其中的細(xì)菌進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究。結(jié)果表明隨溫度升高，堆肥中細(xì)菌多樣性下降，不同時(shí)期的優(yōu)勢菌群不同，高溫階段細(xì)菌種群以嗜熱的芽孢桿菌屬細(xì)菌為主。 為了研究序批式生物膜反應(yīng)器中脫氮細(xì)菌的群落結(jié)

5、構(gòu)及種群變化情況，使用垃圾滲濾液對(duì)一個(gè)3L反應(yīng)器內(nèi)的生物膜進(jìn)行3個(gè)月的馴化后，正常運(yùn)行一個(gè)月，從垃圾滲濾液、馴化結(jié)束、正常運(yùn)行的一個(gè)周期內(nèi)共取樣8個(gè)，使用溶菌酶法提取總DNA，并使用16s rDNA引物對(duì)GC341F/907R進(jìn)行PCR-DGGE分析，結(jié)合使用統(tǒng)計(jì)分析、16S rDNA克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)生物膜細(xì)菌進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究。結(jié)果表明，載體上形成了種群比較豐富、群落結(jié)構(gòu)與功能比較穩(wěn)定的生物膜，其中包括好氧反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧