豬鏈球菌2型MRP的分子致病作用及16S～23S rDNA區(qū)間序列鑒定方法.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是豬鏈球菌病的重要病原，能導(dǎo)致仔豬患腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎，且是一種重要的人畜共患病病原，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生均構(gòu)成嚴(yán)重威脅.本文研究了重組豬鏈球菌2型MRP誘導(dǎo)豬肺巨噬細(xì)胞凋亡，以闡明豬鏈球菌2型的分子致病機(jī)理；建立了基于16S～23SrDNA區(qū)間序列（Intergenic Spacer region，ISR）的鑒定豬源鏈球菌的PCR方法；對(duì)豬鏈球菌

2、1998年江蘇分離株進(jìn)行了病原學(xué)研究。
　　 以純化的重組豬鏈球菌2型MRP蛋白與豬肺巨噬細(xì)胞作用，研究MRP對(duì)豬巨噬細(xì)胞的致病作用，以探討MRP的致病機(jī)制.通過光學(xué)顯微鏡形態(tài)及電子顯微鏡形態(tài)觀察，DNA瓊脂凝膠電泳和流式細(xì)胞儀檢測(cè)等手段，研究MRP對(duì)豬巨噬細(xì)胞的作用.結(jié)果表明，50μg/mL和100μg/mL的重組MRP能誘導(dǎo)豬肺巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，在作用6h后，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下可見感染細(xì)胞呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，DNA

3、瓊脂凝膠電泳呈“梯帶”圖譜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示明顯的亞二倍體DNA峰，凋亡率分別為10.8％和13.32％。證實(shí)MRP是SS2的重要毒力因子.
　　 豬鏈球菌2型與馬鏈球菌獸疫亞種是我國(guó)豬源鏈球菌病的兩種主要病原，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅.本試驗(yàn)利用16S-23SrDNA區(qū)間序列(ISR)的多態(tài)性，結(jié)合16SrDNA和23SrDNA的保守性，分別在16SrDNA末端和23SrDNA前端保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，PCR結(jié)果為23株豬源

4、和8株人源豬鏈球菌2型參考株及分離株擴(kuò)增長(zhǎng)度約為1180bp，1株豬鏈球菌2型弱毒株(T15)為1070bp，25株馬鏈球菌獸疫亞種約為1390bp，因此由PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度可區(qū)分豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種，從而達(dá)到一對(duì)引物區(qū)分兩種細(xì)菌的目的。另外，針對(duì)豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種，分別在16S-23S rDNA區(qū)間序列內(nèi)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，結(jié)果顯示能特異性地?cái)U(kuò)增出230和190bp的目的片段。由此，基于16S-23SrDNA ISR的PCR技

5、術(shù)能鑒定豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種。對(duì)三株代表菌(HA9801，T15，ATCC35246)的16S-23S rDNA ISR進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，種的差異表現(xiàn)為堿基的插入和缺失，此對(duì)引物為區(qū)分豬鏈球菌2型強(qiáng)毒和弱毒株提供了可能。
　　 取1998年在江蘇分離的3株豬源鏈球菌，進(jìn)行了病原學(xué)鑒定。其形態(tài)、染色均符合鏈球菌的特點(diǎn)，具α或β溶血，生化試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。用國(guó)際通用的鏈球菌乳膠分型診斷液檢測(cè)上述分離株，均不在其檢測(cè)范圍，即不屬于