豬鏈球菌2型Sortases、CcpA和SodA功能與致病能力研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(SS2)是一種重要的人獸共患致病菌，可引起仔豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎以及斷奶仔豬的猝死，并可感染人。在已知的33個(gè)血清型中，血清2型的致病力最強(qiáng)，流行范圍最廣。1998年和2005年，我國江蘇和四川分別發(fā)生了人感染豬鏈球菌2型的公共衛(wèi)生事件。
　　 細(xì)菌的粘附、侵襲和抗吞噬功能在致病過程中起著關(guān)鍵作用。SS2的致病性與其對(duì)支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和侵襲以及抗吞噬作用有關(guān)。已知的pgdA可

2、通過參與細(xì)胞壁的合成而抵抗吞噬細(xì)胞殺滅，使SS2的毒力下降;SrtA遞呈具備LPXTG基序的基因到細(xì)胞表面，從而介導(dǎo)細(xì)菌的粘附能力。但SS2確切的致病機(jī)制尚未闡明。我們通過生物信息學(xué)和比較功能基因組學(xué)，發(fā)現(xiàn)SS2可能參與介導(dǎo)細(xì)胞粘附的基因-分選酶、糖代謝調(diào)控的基因-CcpA和抗氧化應(yīng)激的基因-SodA，目前國內(nèi)外未見系統(tǒng)報(bào)道。在通過這些基因的插入失活和基因互補(bǔ)后，證明了其相關(guān)功能和作用。
　　 1、豬鏈球菌2型的基因型與毒力研究

3、:對(duì)2006-2010年在浙江省屠宰場和豬場分離獲得的42株豬鏈球菌2型菌株進(jìn)行毒力基因分析，證明了其基因型主要為GDH+MRP+EF+CPS+ SLY+，占全部分離株的93％。只有2株細(xì)菌為89kb+。根據(jù)豬鏈球菌MLST結(jié)果顯示，上述豬鏈球菌2型分離菌株分別屬于ST1和ST27復(fù)合群。菌毛分型分為3個(gè)基因型，A、B和N型。A型對(duì)應(yīng)ST1復(fù)合群，B型對(duì)應(yīng)ST27復(fù)合群。還發(fā)現(xiàn)了一種新的菌毛型，N型。A型和N型的粘附、抗吞噬能力和對(duì)小鼠

4、的毒力要明顯高于B型(P＜0.05)。
　　 2、分選酶與致病性:分選酶是革蘭氏陽性細(xì)菌中普遍存在的一類酶蛋白，主要功能是能把細(xì)菌內(nèi)含有LPXTG基序的蛋白遞呈到細(xì)菌表面，后者與細(xì)胞相互作用，從而引起宿主致病。通過分析SS2的全基因序列，發(fā)現(xiàn)存在5種不同的分選酶基因，分別為(SrtA、SrtBCD、SrtE、SrtF和SrtG)。敲除這些基因后，SrtA、SrtE和SrtG缺失菌株對(duì)細(xì)胞的粘附、侵襲和跨細(xì)胞能力顯著降低（P＜0.

5、05）。在小鼠致病性試驗(yàn)中，SrtA、SrtE和SrtG缺失菌株比親本菌株具有顯著性差異，缺失菌株的致死率分別為20％，30％和30％，而二個(gè)不同的親本菌株為90％和80％。SrtBCD和SrtF缺失菌株對(duì)細(xì)胞粘附、侵襲和在小鼠毒力試驗(yàn)的結(jié)果與親本株相似(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)果證明了SrtA、SrtE和SrtG基因參與了SS2對(duì)于細(xì)胞粘附、侵襲和跨細(xì)胞作用，同時(shí)也影響細(xì)菌致病性。
　　 3、CcpA的代謝與致病性:CcpA是革

6、蘭氏陽性細(xì)菌一個(gè)重要的碳抑制性代謝基因。通過同源重組敲除該基因后，在糖代謝試驗(yàn)中，通過加入抑制性糖-葡萄糖或蔗糖，同時(shí)分別與纖維二糖，棉籽糖和甘露糖組成雙糖培養(yǎng)基，突變菌株比野生菌株能更顯著的提高分解棉籽糖和纖維二糖的酶蛋白合成，突變株的酶活性濃度通過OD400表示分別為1.22和0.78，親本株的酶活性濃度明顯被抑制，OD400只有0.2和0.25(P＜0.01)?；パa(bǔ)菌株酶蛋白合成能力與親本株相似。熒光定量PCR證明突變菌株能下調(diào)s

7、ly, eno和cps2a毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，它們與親本株的比例分別為34％、19％和34％(P＜0.05)。細(xì)胞試驗(yàn)中證明CcpA基因缺失菌株能顯著引起粘附和侵襲能力下降，分別0.38％和11％，而親本菌株為0.62％和19％(P＜0.05)。在小鼠致死率上，突變菌株為20％，而親本菌株在三天后全部死亡，死亡率為100％?；パa(bǔ)菌株在上述試驗(yàn)中的功能得到恢復(fù)。由此證明在SS2中CcpA基因不但調(diào)控碳的代謝還對(duì)毒力有重要的調(diào)控作用。

8、>　　 4、SodA基因與致病性:細(xì)菌中SodA的主要作用是能催化在吞噬細(xì)胞中由呼吸爆發(fā)所釋放的超氧化離子。通過研究SS2的全基因組發(fā)現(xiàn)SSU1356序列編碼201個(gè)氨基酸的SodA基因。通過構(gòu)建SodA突變菌株，發(fā)現(xiàn)在非變性膠中，突變菌株喪失SodA的活性。體外試驗(yàn)證明:在細(xì)菌與H2O2或百草枯共培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)后，SodA突變菌株比野生菌株更容易被它們所引起的氧化反應(yīng)所抑制，細(xì)菌濃度通過OD600表示，分別為0.13和0.11，而親本

9、株的生長明顯渾濁，OD600為0.45和0.48。在細(xì)胞試驗(yàn)中，吞噬細(xì)胞系RAW264.7更容易殺滅SodA缺失株，在1.5小時(shí)內(nèi)，細(xì)菌率為存活率28％，而親本株的存活率為52％（P＜0.05）。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，器官中細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法證明SodA缺失菌株更容易被體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺滅，體內(nèi)競爭試驗(yàn)(CI)結(jié)果證明:野生株/突變株的CI值分別為:血=0.0028、腦=0.0011、腎=0.001、肝=0.0013、脾=0.0012，其數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于

10、野生株/互補(bǔ)株的CI值(0.25-0.4)（P＜0.01）。小鼠死亡率的比較中，突變菌株的致死率顯著的低于野生菌株，分別為20％和100％。在構(gòu)建SodA互補(bǔ)菌株后，其相關(guān)功能得到恢復(fù)。
　　 5、SS2菌毛蛋白分析和保護(hù)力研究:菌毛作為細(xì)菌重要的附屬結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌的粘附和侵襲方面起著關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是亞單位疫苗的候選蛋白。分析豬鏈球菌2型的全基因組后，存在一個(gè)SrtG cluster的菌毛基因簇，具備二個(gè)與菌毛蛋白類似的基因，分

11、別為Sgp1和Sgp2?？寺?，表達(dá)這兩個(gè)蛋白后制備其抗體，該抗體與SS2通過ELISA、WB和免疫膠體金電鏡試驗(yàn)后可以確定這2個(gè)基因是編碼細(xì)胞表面類似的菌毛樣蛋白。在免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，以整個(gè)蛋白(Sgp1+Sgp2)進(jìn)行免疫，其保護(hù)力可以達(dá)到80％，而PBS對(duì)照組的存活率為20％。由此推斷SrtG菌毛簇的Sgp1和Sgp2可以作為亞單位疫苗的候選蛋白。
　　 本研究證實(shí)浙江地區(qū)的SS2分離菌株以菌毛A和B型為主，其中A型的毒力要顯