豬鏈球菌2型Spx調(diào)節(jié)因子和NADH氧化酶的致病性研究.pdf

1、作為一種重要的人獸共患病原菌，豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)不僅給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重危害公眾健康。豬鏈球菌感染豬會(huì)導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎，甚至急性死亡;其感染人會(huì)導(dǎo)致腦膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征等。根據(jù)莢膜多糖抗原的差異，豬鏈球菌可以分為33個(gè)血清型。其中血清2型是世界范圍內(nèi)致病性最強(qiáng)，臨床分離率最高的血清型。截止到2012年，人感染豬鏈球菌病例總數(shù)接近1600例，是2009

2、年數(shù)據(jù)的兩倍。尤其是1998年和2005年，中國(guó)江蘇和四川分別暴發(fā)大規(guī)模豬鏈球菌疫情，不僅造成大量豬死亡，也導(dǎo)致多人感染和死亡。此外，豬鏈球菌還被鑒定為越南成人腦膜炎的第一大致病因，泰國(guó)的第二大致病因，香港社區(qū)獲得性細(xì)菌腦膜炎的第三大致病因。
　　在感染宿主過(guò)程中，豬鏈球菌會(huì)遭遇各種不利條件，因此需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)來(lái)感知和應(yīng)答環(huán)境信號(hào)。目前，一些雙組分調(diào)控系統(tǒng)和一般調(diào)節(jié)因子已經(jīng)被證實(shí)調(diào)控豬鏈球菌的環(huán)境適應(yīng)性和致病性。Spx蛋白是一類

3、全局性調(diào)節(jié)因子，在低GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌中高度保守。Spx被報(bào)道調(diào)控多種細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)和毒力，但其在豬鏈球菌中的作用仍然未知。因此，本課題探討了豬鏈球菌2型Spx調(diào)節(jié)因子的功能，發(fā)現(xiàn)Spx調(diào)節(jié)因子調(diào)控豬鏈球菌2型的應(yīng)激反應(yīng)和致病性。在此基礎(chǔ)上，篩選4個(gè)受SpxA1調(diào)控的基因（0350、nox、tpx和copA），探討其在豬鏈球菌2型氧化應(yīng)激反應(yīng)和毒力中的作用，發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶影響豬鏈球菌2型的抗氧化應(yīng)激能力和致病性。具體研究?jī)?nèi)容如下

4、:
　　1.豬鏈球菌2型Spx調(diào)節(jié)因子的功能研究
　　在豬鏈球菌2型中鑒定了兩個(gè)Spx調(diào)節(jié)因子，分別命名為SpxA1和SpxA2。多序列比對(duì)結(jié)果顯示豬鏈球菌的Spx蛋白與其它細(xì)菌的Spx調(diào)節(jié)因子具有極高的同源性，推測(cè)Spx在豬鏈球菌中具有重要功能。用同源重組的方法構(gòu)建了兩個(gè)調(diào)節(jié)因子的基因缺失突變株ΔspxA1和ΔspxA2。通過(guò)比較突變株和野生株在不同應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)曲線，研究Spx調(diào)節(jié)因子在豬鏈球菌2型應(yīng)激反應(yīng)中的作用。發(fā)

5、現(xiàn)SpxA1影響豬鏈球菌2型的氧化應(yīng)激反應(yīng);SpxA2影響豬鏈球菌2型的氯化鈉和SDS應(yīng)激反應(yīng);兩個(gè)Spx調(diào)節(jié)因子均影響豬鏈球菌2型的營(yíng)養(yǎng)代謝。用小鼠感染模型評(píng)估突變株和野生株的致病性，證實(shí)兩個(gè)Spx調(diào)節(jié)因子調(diào)控豬鏈球菌2型的組織定植和誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生炎性因子的能力。全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，分布于多個(gè)功能類別的大量基因在突變株中差異表達(dá)，說(shuō)明Spx調(diào)節(jié)因子發(fā)揮全局性調(diào)控作用。
　　2.NADH氧化酶影響豬鏈球菌2型的氧化應(yīng)激反應(yīng)和

6、致病性
　　基于基因芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)查閱，篩選4個(gè)在ΔspxA1突變株中顯著下調(diào)的基因，探討其在豬鏈球菌2型氧化應(yīng)激反應(yīng)和毒力中的作用。通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建4個(gè)基因的缺失突變株。比較突變株和野生株在正常培養(yǎng)和氧化應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)曲線，初步研究4個(gè)基因在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用;用小鼠感染模型評(píng)估突變株和野生株的毒力。結(jié)果顯示NADH氧化酶影響豬鏈球菌2型的抗氧化應(yīng)激能力和毒力。小鼠組織載菌量和炎性因子分析，以及仔豬感染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證