B基因型和C基因型HBV轉(zhuǎn)錄活性差異的機(jī)制研究.pdf

1、目前全世界大約有3.5億人群感染了乙型肝炎病毒(HBV),HBV屬于嗜肝病毒,在復(fù)制周期中需要以前基因組RNA(pgRNA)為模板逆轉(zhuǎn)錄成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(c ccDNA),而逆轉(zhuǎn)錄酶缺少校對(duì)功能,因此在復(fù)制過(guò)程中容易發(fā)生堿基突變,從而形成不同的準(zhǔn)種。當(dāng)病毒基因組的核苷酸差異大于8％時(shí),即形成了不同的基因型。根據(jù)HBV全基因組序列的差異,HBV可以分為10種主要的基因型(A-J),這10種基因型在全世界呈地域性分布,我國(guó)最常見的是基因

2、型B和C。在臨床上,HBV前C區(qū)(PC)G1896A突變和核心啟動(dòng)子區(qū)(BCP)A1762T/G1764A突變可分別會(huì)減弱和阻斷HBeAg的表達(dá),常見于HBeAg陰性慢性乙型肝炎(CHB)患者;與B基因型慢性HBV感染者相比,C基因型感染者的BCP區(qū)突變率較高,HBV活動(dòng)性復(fù)制的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換時(shí)間較晚,且更容易發(fā)展至終末期肝病和肝細(xì)胞肝癌(HCC)。在HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者中,基因型C患者的HBV DNA滴

3、度和HBeAg滴度較高,且更容易發(fā)生BCP區(qū)A1762T/G1764A突變,而基因型B更容易發(fā)生前C區(qū)G1896A突變。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)來(lái)源于B和C基因型CHB患者的臨床分離毒株的生物學(xué)特性報(bào)道較少。Qin等通過(guò)體外分析的方法發(fā)現(xiàn) BCP區(qū)未發(fā)生A1762T/G1764A突變的基因型C pcRNA和前基因組RNA(pg RNA)的轉(zhuǎn)錄水平比基因型B低,BCP區(qū)發(fā)生A1762T/G1764A突變的基因型C轉(zhuǎn)錄水平均明顯增強(qiáng),在野毒株BCP

4、區(qū)人為的引入A1762T/G1764A雙突變也可以明顯增強(qiáng)HBV的轉(zhuǎn)錄水平。因?yàn)楹诵膯?dòng)子直接啟動(dòng)pgRNA和pcRNA的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響基因組復(fù)制,根據(jù)以上研究結(jié)果我們假設(shè)核心啟動(dòng)子的活性是影響B(tài)基因型和C基因型HBV轉(zhuǎn)錄活性差異的主要因素,本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)以上假設(shè)開展了三部分的研究工作。
　　第一部分研究是 B基因型和 C基因型 HBV核心啟動(dòng)子區(qū)序列分析。我們從Genbank下載了453條B基因型HBV全基因序列、525條C基因

5、型序列;另外從慢乙肝患者血清中抽提HBV基因組,構(gòu)建病毒群全基因質(zhì)粒,測(cè)定基因型,然后挑取100條B基因型和100條C基因型單克隆質(zhì)粒。用Vector NTI軟件比對(duì)兩種基因型樣本的核心啟動(dòng)子序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)B基因型 HBV有32％存在A1762T/G1764A突變,C基因型HBV有68％存在A1762T/G1764A突變。(2)B基因型和C基因型核心啟動(dòng)子區(qū)在nt1633、nt1635、nt1636、nt1652、nt1673、

6、nt1730的位置存在差異,并且堿基類型與基因型有關(guān)。
　　第二部分的工作主要是對(duì)B基因型和C基因型HBV標(biāo)本的核心啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析。我們通過(guò)構(gòu)建pGL2表達(dá)質(zhì)粒,分析外源性啟動(dòng)子對(duì)pGL2表達(dá)螢火蟲(Fluc)和海腎熒光素酶(Rluc)的影響。我們?cè)趎t1611-nt1632之間設(shè)計(jì)一條包含SacI酶切位點(diǎn)的上游引物,在nt1862-nt1886之間設(shè)計(jì)一條包含HindIII酶切位點(diǎn)的下游引物, PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段,構(gòu)建含有

7、HBV核心啟動(dòng)子序列的pGL2重組質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Huh7和HepG2細(xì)胞系,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析Fluc/Rluc的比值來(lái)反映外源性啟動(dòng)子活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)在Huh7和HepG2細(xì)胞系中HBV B基因型核心啟動(dòng)子活性顯著強(qiáng)于C基因型(P<0.05)。(2)相同基因型的標(biāo)本之間的核心啟動(dòng)子活性存在差異,對(duì)應(yīng)的核心啟動(dòng)子序列也不相同。(3)核心啟動(dòng)子活性和HBV體外轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。該結(jié)果初步驗(yàn)證了HBV基因型B和基因型C啟動(dòng)子活

8、性的差異是影響這兩種基因型體外轉(zhuǎn)錄活性差異的主要因素的假設(shè)。
　　在第三部分中,根據(jù)本研究第一部分HBV基因型B和C啟動(dòng)子區(qū)序列比對(duì)結(jié)果,我們采用定點(diǎn)突變的方法對(duì)上述構(gòu)建的pGL2質(zhì)粒中HBV基因型B和基因型C啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)突變,把nt1633、nt1635、nt1636、nt1652、nt1673、nt1730位置的堿基突變成另一種基因型相同位點(diǎn)的堿基類型,然后分析堿基突變前后雙熒光素酶表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)nt1633