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文檔簡(jiǎn)介
1、全球約3.5億人被感染慢性乙型肝炎病毒,慢性乙型肝炎易引起肝硬化及肝癌,嚴(yán)重威脅人類健康。慢性乙型肝炎的治療對(duì)肝硬化及肝癌的防治具有重要意義。以前對(duì)乙型肝炎的診斷及病情檢測(cè)多使用生化學(xué)免疫學(xué)指標(biāo),近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于乙型肝炎的臨床診療,如乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)和乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)。目前乙型肝炎病毒定量檢測(cè)多使用實(shí)時(shí)熒光PCR方法,其對(duì)于慢性乙型肝炎患者的診斷、患者治療時(shí)機(jī)的決定以及治療中治療后療效的評(píng)估及預(yù)后判斷具有
2、重要意義。本課題旨在針對(duì)不同HBV分型,比較某國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)試劑與羅氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan(CAP/CTM)方法檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)DNA的結(jié)果,找出國(guó)產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑在敏感度、特異度方面的差距,為提高國(guó)產(chǎn)試劑性能打下理論基礎(chǔ)。本研究還使用sanger雙脫氧測(cè)序法(HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn))商品試劑盒和基于sanger雙脫氧測(cè)序法自設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)體系對(duì)反向雜交芯片法進(jìn)行了驗(yàn)證,以
3、研究此方法可靠性如何,是否可用于臨床HBV病毒分型檢測(cè)。
本文研究?jī)?nèi)容如下:
(1)抽取72份慢性乙型肝炎血清標(biāo)本,采用COBAS Amplicor的FQ-PCR試劑(A)和國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)FQ-PCR試劑(B)對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA對(duì)比檢測(cè),分析針對(duì)不同HBV分型樣本時(shí),使用COBAS Amplicor檢測(cè)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)試劑的敏感度、特異度及與試劑A的相關(guān)性。結(jié)果:A、B兩種試劑檢測(cè)結(jié)果總體相關(guān)性良好(r=0.94)
4、,定量檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A、B兩種試劑檢測(cè)低載量樣本時(shí),相關(guān)系數(shù)較低(r=0.31),B試劑在檢測(cè)低載量樣本時(shí)可靠度較差。A、B兩試劑檢測(cè)不同基因型別樣本結(jié)果相關(guān)性較好(r>0.85),結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(2)對(duì)所抽取72份HBV病毒血清樣本進(jìn)行HBV分型(反向斑點(diǎn)雜交芯片法),再?gòu)?2份樣本中隨機(jī)選取部分(20個(gè)樣品)分別用sanger測(cè)序法商品試劑盒體系和自設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行雙重驗(yàn)證,研究?jī)煞N病
5、毒基因分型方法差異,并在NCBI上進(jìn)行分型比對(duì)。結(jié)果:PCR反向斑點(diǎn)雜交芯片法與sanger雙脫氧測(cè)序法檢測(cè)相符率高,可用于臨床HBV病毒分型檢測(cè)。
(3)根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析討論并總結(jié)進(jìn)口國(guó)產(chǎn)兩種檢測(cè)試劑主要差異在于檢測(cè)低載量樣本時(shí)國(guó)產(chǎn)試劑(試劑B)可靠度低于進(jìn)口試劑(試劑A),國(guó)產(chǎn)試劑(試劑B)在檢測(cè)兩例病毒載量<104IU/mL樣本時(shí)發(fā)生漏檢(基因型分別為B型和C/E混合型),實(shí)驗(yàn)漏檢率為2.7%。
(4)為進(jìn)
6、一步研究HBV病毒分型方法,本論文自設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)體系檢測(cè)HBVDNA病毒分型,結(jié)果與反向雜交法商品試劑盒和直接測(cè)序法商品試劑盒相符率高,成本低,可用于臨床檢驗(yàn)與科研。
結(jié)論:由本研究所得結(jié)果,建議國(guó)產(chǎn)試劑改良核酸提取方法,使用高得率的提取方法(如磁珠法),如有技術(shù)條件可嘗試研發(fā)機(jī)械全自動(dòng)提取設(shè)備,并加大PCR整體反應(yīng)體系,引進(jìn)內(nèi)標(biāo)質(zhì)控,使用保守區(qū)多對(duì)結(jié)合引物,提高試劑靈敏度可靠性與特異性,就可有望替代進(jìn)口試劑,降低病人診療費(fèi)用與經(jīng)
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