腫瘤相關(guān)基因CLDND1表達產(chǎn)物的分析與檢測.pdf

1、目的：利用生物信息學分析假想蛋白 CLDND1結(jié)構(gòu)組成，預測其結(jié)構(gòu)及功能；通過制備融合蛋白CLDND1多克隆抗體，在CLDND1 mRNAs高表達的腫瘤細胞及組織中進行定性及定量檢測，期望為CLDND1基因的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：利用Northern blot技術(shù)分析CLDND1基因的mRNA在人不同組織器官表達特異性。生物信息學分析預測CLDND1蛋白結(jié)構(gòu)組成、保守性、親水性、免疫原性等理化特性，RT-PCR體外擴增

2、CLDND1編碼框序列，將擴增到的目的基因片段插入到原核表達載體 pET-32a相應酶切位點，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-CLDND1，驗證重組成功后，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21菌株，IPTG誘導蛋白表達，用融合蛋白對新西蘭大白兔進行免疫，收集并純化抗血清，獲得純度較高的多克隆抗體，ELISA測定抗體效價，Western blot檢測抗體特異性并進行內(nèi)源蛋白檢測，利用獲得的抗體通過免疫共沉淀純化目標蛋白并送測序。<

3、br>　　結(jié)果：
　　（1）Northern blot技術(shù)檢測CLDND1的mRNA表達水平在正常的神經(jīng)組織中高表達，在其他的正常器官組織中不表達或低表達，而在多種腫瘤細胞中也呈現(xiàn)高表達的趨勢；
　?。?）生物信息學分析顯示該蛋白有四個跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該段序列與大鼠、小鼠同源性高達93％，第28-138個氨基酸(Aa)處免疫原性較好，較適合制備抗體；
　?。?）成功構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET-32a-CLDND1(28

4、-138 Aa），并表達出約35 kDa的帶標簽的融合蛋白；
　?。?）制備出了CLDND1蛋白的多克隆抗體，ELISA測定CLDND1蛋白的多克隆抗體效價在1︰128000，Western blot檢測抗體特異性較好；
　　（5）Western blot檢測到預計目的條帶的存在，但有多帶現(xiàn)象；
　?。?）蛋白樣品 SDS-PAGE切膠質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀后質(zhì)譜鑒定均未獲得與CLDND1預測蛋白序列相符合的蛋白質(zhì)。