雞Ii與B-L基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞定位與結(jié)合活性特征的研究.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）是由一群位于脊椎動(dòng)物特定染色體區(qū)域基因所編碼的高度多態(tài)性蛋白分子。MHC分子分布于不同細(xì)胞表面，通過呈遞抗原來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。不同種動(dòng)物的MHC及其對(duì)應(yīng)編碼產(chǎn)物的名稱各不相同。MHC分子家族中的II類分子是由α、β兩條鏈組成的異二聚體。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，它與自己的γ鏈聚合，形成九聚體。因?yàn)棣面湶煌讦梁挺骆?，呈非多態(tài)性，因此稱恒定鏈（Invaria

2、nt chain, Ii）。作為MHC II分子的重要伴侶蛋白分子，Ii輔助MHC II分子的正確折疊、組裝、結(jié)構(gòu)維持和協(xié)助呈遞外源性抗原肽。在與MHC II分子的α、β鏈形成九聚體的過程中，其CLIP區(qū)(the class-II associated Ii chain peptide)占據(jù)MHC II類分子的抗原結(jié)合槽，阻止內(nèi)源性抗原肽與MHC II類分子結(jié)合。
　　Ii與MHC分子的相互作用主要通過真核細(xì)胞和原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)

3、行研究。在真核表達(dá)中，通過共轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，再用激光共聚焦和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察Ii與MHC分子的相互關(guān)系。由于在這兩個(gè)分子間關(guān)系中，需要檢測(cè)分子間親和力關(guān)系，但是現(xiàn)有的動(dòng)物真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物難以滿足這類實(shí)驗(yàn)。為此，本研究探索應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)目的蛋白，以此研究兩種分子間的相互作用。
　　首先，根據(jù)GenBank雞Ii（登錄號(hào)：AY597053）、B-LA（AY357254）和B-LB（S66480）基因序列，利用自行設(shè)計(jì)的引

4、物，從實(shí)驗(yàn)室保存的各基因cDNA克隆雞的 Ii、B-LA和 B-LB全長編碼區(qū)域，將克隆的基因片段分別插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和pET-28a，以及真核表達(dá)載體pEGFP-C1和pEGFP-N1中，分別用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta（DE3）和轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)真核蛋白。經(jīng) PCR、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建6個(gè)重組質(zhì)粒。
　　其次，將原核表達(dá)產(chǎn)物分別經(jīng)反復(fù)凍融和超聲裂解處理，GST-Ii蛋白經(jīng) GS

5、T親和層析柱（Glutathione Sepharose4B）進(jìn)行蛋白純化，His/B-LA和His/B-LB經(jīng)鎳柱進(jìn)行純化。在SDS-PAGE電泳中，GST-Ii蛋白分子量為50.8 kD，His/B-LA蛋白分子量為34.1 kD，His/B-LB蛋白分子量為35.3 kD，GFP-Ii蛋白分子量為54.17 kD， GFP-B-LA蛋白分子量為54.84 kD，GFP-B-LB蛋白分子量為56.04 kD，與預(yù)期大小一致。用這些蛋

6、白復(fù)性后分別免疫小鼠，獲得特異性抗體。再用進(jìn)行經(jīng)真核表達(dá)的相應(yīng)蛋白作為免疫印跡檢測(cè)抗原，結(jié)果表明這些原核表達(dá)產(chǎn)物所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能識(shí)別和真核表達(dá)蛋白。
　　再次，將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-C-Ii，pEGFP-N1-B-LA或pEGFP-N1-B-LB分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，觀察它們?cè)谡婧思?xì)胞中表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果表明，它們均能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并分布于漿膜系統(tǒng)。
　　最后，為檢測(cè)原核表達(dá)的 Ii、B-LA和 B

7、-LB具有互相結(jié)合的功能，將pGEX-4T-1-C-Ii與pET-28a-B-LA或 pET-28a-B-LB共轉(zhuǎn)染工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和復(fù)性后，用Glutathione Sepharose4B親和層析提取結(jié)合的復(fù)合物。結(jié)果表明，共表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和柱提純后，在未經(jīng)SDS處理的PAGE中，出現(xiàn)復(fù)合物Ii/B-LA和Ii/B-LB，再用SDS處理并進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)在SDS-PAGE中這些復(fù)合物被解離成相應(yīng)的2個(gè)單體條帶。
　　上述這些結(jié)果表