嗜水氣單胞菌主要粘附素基因序列及其重組基因表達(dá)產(chǎn)物功能分析.pdf

1、為了深入探討不同嗜水氣單胞菌(Ah)之間主要粘附素基因在序列方面的差異以及主要粘附素的功能,了解主要粘附素在菌體侵入宿主和介導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫過程可能扮演的角色,對(duì)6株Ah菌主要粘附素基因進(jìn)行克隆、測(cè)序,同時(shí)對(duì)Ah菌ZN1株主要粘附素重組基因的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的部分生物學(xué)功能進(jìn)行了分析,獲得如下結(jié)果。
　　 核苷酸和氨基酸序列分析結(jié)果表明:6株Ah菌主要粘附素基因核苷酸和氨基酸同源率范圍分別為35.6％～99.6％和

2、34.2％～99.5％;相同來源且相同血清型的菌株BL①和BL④之間,主要粘附素基因核苷酸同源性最高為99.6％,對(duì)應(yīng)氨基酸的同源性為84.6％;不同來源且不同血清型的菌株BL①和TPS-30之間主要粘附素基因核苷酸同源性為98.1％,對(duì)應(yīng)氨基酸的同源性僅42.3％;此外,菌株ZN1(血清型為0:10501、分離自歐洲鰻鱺)的主要粘附素氨基酸序列與其他菌株差異較大同源率僅為34.2％～63.6％。結(jié)果提示嗜水氣單胞菌菌株間主要粘附素基因

3、核苷酸和氨基酸同源性與菌株來源和血清型沒有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南嚓P(guān)性,而呈現(xiàn)出一定的多樣性。
　　 主要粘附素基因重組表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果表明:嗜水氣單胞菌ZN1株主要粘附素基因(Mah)重組菌.Ecoli BL21(命名為ZAPB)在誘導(dǎo)前增菌4hrs、5hrs的表達(dá)效果優(yōu)于增菌2hrs、3hrs;在添加不同誘導(dǎo)物IPTG濃度(0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L)條件下,表達(dá)效果相近;誘導(dǎo)表達(dá)2hrs

4、、3hrs的效果優(yōu)于4hrs和5hrs;在27℃條件下,誘導(dǎo)表達(dá)的效果優(yōu)于30℃、33℃和37℃;此外,增加通氧量、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值(分別為6.0和8.0)和低溫延時(shí)表達(dá)(16℃誘導(dǎo)8h)都不能改善表達(dá)效果,且表達(dá)產(chǎn)物也主要以包涵體的形式存在。結(jié)果表明ZAPB最佳表達(dá)條件為:搖床轉(zhuǎn)速200r/min,誘導(dǎo)前預(yù)增菌4hrs,菌液濃度在OD600=0.6～0.8之間,誘導(dǎo)物IPTG濃度為0.5mmol/L,誘導(dǎo)溫度27℃,誘導(dǎo)表達(dá)3hrs。

5、
　　 主要粘附素基因重組表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)特性與功能分析的結(jié)果表明:(1)交叉EIASA結(jié)果顯示,兔抗基因供體菌ZN1株的天然外膜蛋白(ZN1-OMP)血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物Mah-TrxA(硫氧還蛋白與主要粘附素形成的融合蛋白)及ZN1-OMP的反應(yīng)滴度分別為1∶3200和1∶12800;兔抗Mah-TrxA血清對(duì)Mah-TrxA及ZN1-OMP的反應(yīng)滴度分別為1∶12800和1∶1600,說明表達(dá)產(chǎn)物和天然外膜蛋白具有類似的免疫學(xué)特性

6、。(2)粘附試驗(yàn)顯示,魚源Ah菌ZN1株和BL①株(血清型O:Ah10501)、TPS-30株和Ah9805株(血清型0:9)及CQ-3株(血清型O:CQ-1)對(duì)鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC)的相對(duì)粘附率高達(dá)97％以上;非魚源Ah菌ATCC7966株(血清型O:1)對(duì)EPC的相對(duì)粘附率為78.5％。(3)粘附抑制和阻斷試驗(yàn)顯示,EPC經(jīng)Mah-TrxA預(yù)孵育后,與不同Ah菌株進(jìn)行粘附試驗(yàn),EPC的平均粘附菌數(shù)僅為0.3～3.9(＜10);供試

7、的不同Ah菌株經(jīng)兔抗Mah-TrxA血清預(yù)孵育后,與EPC進(jìn)行粘附試驗(yàn),EPC的平均粘附菌數(shù)也僅為0.3～3.7(＜10)。結(jié)果提示Mah-TrxA對(duì)不同Ah菌株有交叉抑制的作用,抗原競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)和抗體阻斷試驗(yàn)均能顯著減少不同Ah菌株對(duì)EPC的粘附作用,從正反兩個(gè)方面都提示克隆、表達(dá)的Mah-TrxA確為ZN1菌株的主要粘附素:同時(shí)還證實(shí)借助基因工程技術(shù)以融合蛋白形式表達(dá)的Mah-TrxA與野生菌株ZN1表達(dá)的主要粘附素具有類似的生物

8、學(xué)活性。
　　 綜上所述,本研究課題分析比較了6株不同Ah菌主要粘附素基因的核苷酸和氨基酸的同源性,闡明Ah主要粘附素基因同源性與菌株來源和血清型沒有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南嚓P(guān)性;驗(yàn)證了Mah-TrxA對(duì)魚類細(xì)胞的粘附功能,證實(shí)了Mah是ZN1菌株的主要粘附素基因;交叉抑制試驗(yàn)證明Mah-TrxA融合蛋白能夠抑制不同來源和血清型Ah菌株對(duì)EPC的粘附,結(jié)果提示不同Ah菌株的粘附位點(diǎn)具有一定的保守性。這一發(fā)現(xiàn)也許能為魚類嗜水氣單胞菌疾病的防控提供