嗜水氣單胞菌粘附相關(guān)基因鑒定及其功能研究.pdf

1、粘附是致病菌對宿主進行感染的關(guān)鍵，病原菌通過粘附因子可在宿主的體表或特定組織定植，入侵增殖并發(fā)揮毒力。近年來，粘附已經(jīng)被認為是致病菌的一個毒力因子。關(guān)于臨床病原菌粘附的研究得到廣泛關(guān)注，但水產(chǎn)病原菌粘附及粘附機制的研究還相當欠缺。
　　本研究以水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中重要的病原菌嗜水氣單胞菌W菌株為研究對象，首先采用改良后的間接ELISA法研究了嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的粘附特性。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌對鰻鱺的

2、表皮粘液具有良好的粘附作用，且其粘附能力受初始菌液的濃度、溫度、孵育時間、pH值、離子濃度以及營養(yǎng)要素等環(huán)境因子影響。
　　在充分了解嗜水氣單胞菌粘附特性的基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)構(gòu)建嗜水氣單胞菌野生型菌株 W的突變庫，并從突變庫中篩選到9株粘附能力穩(wěn)定下降的突變菌株。PCR鑒定證明這些突變株為轉(zhuǎn)座子 mini-Tn10插入突變， southern雜交證明這些突變株中mini-Tn10均為單位點插入。Genome walking

3、技術(shù)擴增突變株插入位點的側(cè)翼序列，經(jīng)過克隆、測序得到側(cè)翼基因序列信息。通過序列比對分析，結(jié)果顯示：121號突變株轉(zhuǎn)座子插入位點均為flgC基因，45號突變株的插入位點為調(diào)控CobQ/CobB/MinD/ParA蛋白家族的基因，77號突變株的插入位點為flgN基因，196基因的插入位點為RbsR基因以及261號突變株的插入位點為CydDC基因，而163號突變株的插入位點側(cè)翼序列在NCBI中沒有找到同源序列。
　　進一步對flgC基因

4、在嗜水氣單胞菌粘附中的功能進行研究。首先將flgC基因及其RBS位點克隆至表達載體pACYC184構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pACYC184+flgC,然后將重組表達載體電轉(zhuǎn)至相應(yīng)突變株中，構(gòu)建補償菌株。Western blotting證實重組表達載體中flgC可在突變株中得到表達。對野生株、突變株、補償株的運動、粘附及生物膜形成等表型特征進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型和互補菌株相比，flgC基因突變株在運動、粘附及生物膜形成等方面都明顯降低，表