飛蝗幾丁質(zhì)脫乙?；富虻漠愒幢磉_(dá)及其在后腸中的功能研究.pdf

1、飛蝗是我國(guó)重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，目前對(duì)其防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但不合理的化學(xué)防治不僅導(dǎo)致環(huán)境的污染，而且導(dǎo)致飛蝗抗藥性的產(chǎn)生和對(duì)非靶標(biāo)生物的危害。因此，探索新型、環(huán)境友好型飛蝗防治方法日趨重要。
　　昆蟲(chóng)的發(fā)育會(huì)發(fā)生周期性去除舊表皮的幾丁質(zhì)代謝過(guò)程。幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮、消化道及體內(nèi)組織所特有的組成成分。在幾丁質(zhì)降解過(guò)程中幾丁質(zhì)脫乙酰基酶（CDAs）起重要作用，可以催化幾丁質(zhì)中由β-1,4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０坊撊ヒ阴；?，形成

2、脫乙酰幾丁質(zhì)（殼聚糖）。因此，基于昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)降解途徑研發(fā)環(huán)境友好型殺蟲(chóng)劑備受關(guān)注。
　　本研究以飛蝗LmCDAs基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用真核表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)體外表達(dá)目的基因、純化目的蛋白，并對(duì)其酶活力進(jìn)行檢測(cè)，從而探索該蛋白基因在體外的脫乙酰功能；其次，本研究還對(duì)該基因進(jìn)行了原核表達(dá)和親和純化，并制備其特異性的多克隆抗體，為探索該基因在飛蝗后腸的功能研究提供了基礎(chǔ)材料；最后，基于課題組前期的研究基礎(chǔ)，我們使用制備成功的特異性多克隆抗體探

3、索LmCDA1和LmCDA2基因?qū)︼w蝗后腸發(fā)育的影響。該研究為探討基因在幾丁質(zhì)代謝過(guò)程中的功能特性提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為篩選殺蟲(chóng)劑新靶標(biāo)，研發(fā)環(huán)境友好型殺蟲(chóng)劑以及以農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)飛蝗的幾丁質(zhì)作為底物的殼聚糖生產(chǎn)方法提供理論依據(jù)。本文主要從以下三個(gè)內(nèi)容進(jìn)行研究：
　　一、飛蝗LmCDA1和LmCDA2的真核表達(dá)、親和純化及酶活性研究
　　采用PCR法擴(kuò)增飛蝗LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b基因，純化回收后瓊脂糖凝膠電

4、泳檢測(cè)回收產(chǎn)物。選擇pFastBac?-Dual作為中間載體，將中間載體和回收產(chǎn)物雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。隨后進(jìn)行重組桿狀病毒的構(gòu)建。將構(gòu)建好的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組LmCDAs蛋白，通過(guò)western blot和12％SDS-PAGE膠上電泳等方法驗(yàn)證、純化重組LmCDAs蛋白，并進(jìn)行初步的酶活力測(cè)定。
　　結(jié)論：飛蝗幾丁質(zhì)脫乙?；窵mCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b在體外均具有脫乙酰功能，并且統(tǒng)計(jì)分析

5、結(jié)果顯示三者在酶活力上表現(xiàn)顯著性差異。
　　二、飛蝗LmCDA1和LmCDA2的原核表達(dá)、純化及抗體制備與驗(yàn)證
　　設(shè)計(jì)引物進(jìn)行目的基因的克隆和純化，選取pET32a作為中間載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-LmCDA1和pET32a-LmCDA2，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，采用Western blot技術(shù)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；將成功表達(dá)的蛋白使用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行目的蛋白的純化，純化組分采

6、用12%SDS-PAGE方法檢測(cè)其純化結(jié)果，然后測(cè)定純化后的蛋白濃度，將濃度達(dá)到10mg的純化蛋白送至生物公司進(jìn)行抗體制備?？贵w合成后，使用Western blot技術(shù)進(jìn)行抗體的驗(yàn)證。
　　結(jié)論：重組載體質(zhì)粒pET32a-LmCDA1和pET32a-LmCDA2可在大腸桿菌中經(jīng)過(guò)100mM IPTG誘導(dǎo)劑，37℃誘導(dǎo)4h獲得目的蛋白的表達(dá)，并且可借助大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得大量目的蛋白以達(dá)到抗體制備所需的濃度和純度。
　　三

7、、LmCDA1和LmCDA2基因在飛蝗后腸中的組織定位和功能分析
　　通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)LmCDAs基因在飛蝗后腸中的組織定位。通過(guò)RNAi干擾與透射電鏡技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)手段，研究LmCDAs基因?qū)︼w蝗后腸發(fā)育的影響。結(jié)論：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示在五齡第8天飛蝗后腸中， LmCDA1和LmCDA2均定位在細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)五齡第8天飛蝗后腸中的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明LmCDA1和LmCDA2基因均對(duì)飛蝗后腸幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的排布起關(guān)鍵