N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫?；富虻目寺∨c原核表達(dá).pdf

1、N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫?；?N-acetylornithine deacetylase，簡(jiǎn)稱(chēng)NAOase；EC3.5.1.16)，具有廣泛的底物特異性，可選擇性地作用于L-型?；被幔蓱?yīng)用于脂肪族氨基酸拆分，在氨基酸生產(chǎn)中具有重要的地位。除此之外，NAOase還可作為靶標(biāo)用于研究新型抗生素。本文主要研究了N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫?；富虻目寺∨c原核表達(dá)。
　　 本文首先通過(guò)設(shè)計(jì)E.coli K12中的N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫酰基酶基因-ar

2、gE兩端的引物，成功獲取了E.coli K12的argE全基因。經(jīng)基因序列比對(duì)表明，所獲基因與GeneBank中的argE基因(X55417)同源性達(dá)到100％，argE基因全長(zhǎng)1152 bp，編碼383個(gè)氨基酸。
　　 本文以pET22b為表達(dá)載體，在正向引物設(shè)計(jì)過(guò)程中，將目的基因的第四個(gè)堿基A突變成G，并與攜帶和不攜帶6*His標(biāo)簽的兩種反向引物組合，構(gòu)建了兩種不同的表達(dá)載體pET22b(+)-argE。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌

3、BL21(DE3)，構(gòu)建了可大量表達(dá)N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫酰基酶的重組菌。經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明兩種重組菌皆可有效表達(dá)argE基因。
　　 結(jié)合兩種重組菌的生物量、表達(dá)量和酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推斷構(gòu)建組合1中在重組NAOase的C末端引入的His標(biāo)簽對(duì)酶的活性無(wú)明顯影響?？紤]到后期純化，選擇以重組菌BL21(DE3)/pET22b-argE1為實(shí)驗(yàn)菌種。分別對(duì)重組菌BL21(DE3)/pET22b-argE的菌體、菌體的培養(yǎng)外液

4、、細(xì)胞質(zhì)可溶部分及不溶組分經(jīng)適當(dāng)處理后進(jìn)行10.0％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表達(dá)產(chǎn)物N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫?；复蠖鄶?shù)以不可溶的包涵體形式表達(dá)，少量以有活性的可溶形式表達(dá)。
　　 在LB液體培養(yǎng)基中，有效提高N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫?；富钚员磉_(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為：采用乳糖為誘導(dǎo)劑，乳糖濃度15.0 g/L，誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)起始OD值為0.46，誘導(dǎo)時(shí)間18 h。Mg+對(duì)酶活及生物量影響不大。在誘導(dǎo)劑乳糖加入2.5 h后加濃度為5.

5、0 mg/L的Zn2+可提高酶活到360 U/mL，為Zn2+添加前的1.3倍，為誘導(dǎo)條件優(yōu)化前30℃誘導(dǎo)時(shí)的6倍，優(yōu)化效果顯著。
　　 將重組菌BL21(DE3)/pET22b-argE分別在LB(+)和LB(-)上連續(xù)培養(yǎng)50代，重組質(zhì)粒pET22b(+)-argE在含有羧芐青霉素選擇壓力下，質(zhì)粒全部存在(100％)；而該質(zhì)粒在不含任何選擇性壓力下，30代前質(zhì)粒能維持在宿主菌中，50代后質(zhì)粒幾乎全部丟失(僅存2％)。采用羧芐