N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸的酶法合成和正選擇表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸是化學(xué)合成扎那米韋的關(guān)鍵中間體,也是合成其他抗流感藥物的主要原料。目前,N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸主要通過酶催化法制備。首先由N-?；?D-葡萄糖胺2-異構(gòu)酶將N-乙酰-D-葡萄糖胺異構(gòu)化為N-乙酰-D-甘露糖胺；從后者到N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸有兩個途徑:一種是神經(jīng)氨酸醛縮酶催化N-乙酰-D-甘露糖胺與丙酮酸之間的縮合而得到N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸；另一種是神經(jīng)氨酸合成酶催化N-乙酰-D-甘露糖胺與磷酸烯醇式丙酮酸縮合為

2、N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸。
　　 本研究通過同源搜索找到與已知神經(jīng)氨酸合成酶具有較高同源性的蛋白,進而在大腸桿菌中進行克隆、表達(dá)和純化。同時測定了不同來源的神經(jīng)氨酸醛縮酶、神經(jīng)氨酸合成酶以及N-?；?D-葡萄糖胺2-異構(gòu)酶的活性。結(jié)果表明來源于大腸桿菌的醛縮酶活性最高,以全細(xì)胞進行催化,37℃下反應(yīng)1h后,神經(jīng)氨酸的摩爾收率最高可以達(dá)到23.31％；來源于腦膜炎雙球菌的神經(jīng)氨酸合成酶在全細(xì)胞水平具有很高的合成酶活性,37℃下全細(xì)胞

3、催化反應(yīng)30分鐘后Neu5Ac的摩爾收率最高可以達(dá)到50.96％;來源于多擬形桿菌的BT0453蛋白的異構(gòu)酶活性較好,與大腸桿菌醛縮酶偶聯(lián)反應(yīng),反應(yīng)時間為4 h后,神經(jīng)氨酸的摩爾收率最高達(dá)到2.77％。
　　 目前將來源自大腸桿菌的三種伴侶蛋白作為融合標(biāo)簽構(gòu)建了伴侶蛋白融合表達(dá)載體。選取All3695和RB3348與伴侶蛋白基因融合表達(dá)。結(jié)果表明,目的基因與三種伴侶蛋白融合表達(dá)的重組蛋白可溶性明顯增加,啟動因子作為融合標(biāo)簽的融合

4、蛋白表達(dá)量最高。BandScan軟件分析表明,all3695基因與啟動因子基因融合表達(dá)時,表達(dá)出95.5KD融合蛋白,所表達(dá)的融合蛋白幾乎均為可溶性蛋白,其可溶性蛋白的表達(dá)量占總表達(dá)蛋白的比例為37.2％,高于all3695單獨表達(dá)時的7.1％的比例；RB3348基因與啟動因子基因融合表達(dá)時,可溶性蛋白的表達(dá)量占總表達(dá)蛋白的比例為53.0％,遠(yuǎn)高于單獨表達(dá)時4.4％的比例。
　　 正選擇克隆載體是一類通過抗生素或化合物對重組克隆

5、進行直接篩選的載體,最大優(yōu)點是其可保證很高的克隆效率,有時可達(dá)100％。有報道顯示β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)在缺失C端密碼子(290位色氨酸密碼子)時,將不能很好的表達(dá)氨芐青霉素抗性功能；而定向插入外源基因后將重建bla的C端密碼子,進而使β-內(nèi)酰胺酶重獲氨芐青霉素抗性功能。本研究將色氨酸缺失的β-內(nèi)酰胺酶基因克隆至帶有TEV蛋白酶酶切位點的表達(dá)載體上,構(gòu)建了正選擇表達(dá)載體pPAE以及pPAE-MBP。選取大腸桿菌醛縮酶nanA和人源腎