重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰神經(jīng)氨酸的途徑構(gòu)建及代謝改造.pdf

1、N-乙酰葡萄糖胺存在于所有生物體中，在人體中是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素及硫酸角質(zhì)素等葡糖胺多糖的二糖單元前體。N-乙酰葡萄糖胺特異性地作用于關(guān)節(jié)軟骨，對于維持軟骨的健康和正常的關(guān)節(jié)功能具有重要作用；N－乙酰葡萄糖胺可以增加皮膚中透明質(zhì)酸的含量；此外N－乙酰葡萄糖胺還是合成N－乙酰神經(jīng)氨酸的前體物質(zhì)。目前N－乙酰葡萄糖胺主要通過水解幾丁質(zhì)合成，化學(xué)法水解環(huán)境污染嚴(yán)重，水解幾丁質(zhì)的酶合成量低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵因其發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高引

2、起了越來越多的關(guān)注。
　　 我們在大腸桿菌中構(gòu)建了N－乙酰葡萄糖胺的發(fā)酵途徑。研究了以甘油為碳源時(shí)，N－乙酰葡萄糖胺的合成情況。利用不同啟動(dòng)子、不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)了N－乙酰葡萄糖胺合成的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)在該發(fā)酵條件下低拷貝質(zhì)粒中N－乙酰葡萄糖胺的產(chǎn)量最高。
　　 我們研究了manXYZ基因編碼的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(EIIMan)轉(zhuǎn)運(yùn)N－乙酰葡萄糖胺的方向，結(jié)果表明該條件下甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)N－乙酰葡萄糖胺。敲除

3、甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因之后，大腸桿菌利用甘油的速率大大加快。
　　 最后我們比較了以甘油或葡萄糖為碳源條件下N－乙酰葡萄糖胺的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)葡萄糖更有利于N－乙酰葡萄糖胺的合成。
　　 N－乙酰神經(jīng)氨酸，是神經(jīng)氨酸家族中最常見的一種，廣泛存在于自然界，是合成其他唾液酸的前體。N－乙酰神經(jīng)氨酸通常位于細(xì)胞表面糖蛋白或者糖脂的末端，參與多種生理功能，如維持生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能、參與細(xì)胞和分子之間的識別和信號傳遞過程等。由于N－

4、乙酰神經(jīng)氨酸的重要生理功能，許多以N－乙酰神經(jīng)氨酸為基礎(chǔ)的藥物被開發(fā)出來，如抗癌藥物、抗粘附藥物和抗病毒藥物。其中抗病毒藥物扎那米韋是N－乙酰神經(jīng)氨酸的類似物，可以治療和預(yù)防A型和B型流感病毒，根據(jù)最新的調(diào)查顯示，目前已經(jīng)出現(xiàn)了抗達(dá)菲的流感病毒變種，但是扎那米韋對這些病毒變種仍然有效。由于N－乙酰神經(jīng)氨酸可以促進(jìn)腦部發(fā)育，因此被添加于嬰幼兒奶粉。
　　 N－乙酰神經(jīng)氨酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是從含量相對豐富的天然產(chǎn)物如燕窩、卵黃膜、乳清

5、當(dāng)中提取，但是這些天然產(chǎn)物中N－乙酰神經(jīng)氨酸的含量較低，即使是N－乙酰神經(jīng)氨酸的含量最高的燕窩中，也僅為67g/kg，加上提取工藝復(fù)雜，限制了N－乙酰神經(jīng)氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)法合成N－乙酰神經(jīng)氨酸需要經(jīng)過多步保護(hù)和去保護(hù)的過程，最后產(chǎn)生消旋型N－乙酰神經(jīng)氨酸，不利于實(shí)際應(yīng)用。隨著N－乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N－乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶的發(fā)現(xiàn)，酶法和全細(xì)胞催化合成N－乙酰神經(jīng)氨酸的方法被開發(fā)出來，使得大規(guī)模合成成為可能。在酶法合成過程中，利用純化

6、的N－乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N－乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶，添加過量的前體物丙酮酸和N－乙酰葡萄糖胺，加入N－乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶的激活劑ATP，合成N－乙酰葡萄糖胺。催化合成反應(yīng)的酶可以重復(fù)利用，但是這個(gè)合成過程需要將兩種酶純化出來，在反應(yīng)過程中還需要額外添加ATP，ATP不能重復(fù)利用且易于水解，增加了生產(chǎn)成本。全細(xì)胞催化利用整個(gè)細(xì)胞作為反應(yīng)器，表達(dá)N－乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N－乙酰葡萄糖胺－2－異構(gòu)酶，催化反應(yīng)在胞內(nèi)進(jìn)行，不需要進(jìn)行酶的純化。但是

7、這一催化過程仍然需要添加前體物丙酮酸和N－乙酰葡萄糖胺，前體物價(jià)格比較昂貴。
　　 近年來，隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，人們通過分析和改造代謝途徑，過量表達(dá)內(nèi)源基因或引入外源基因，構(gòu)建合成特定目標(biāo)化合物的工程菌株并用于工業(yè)化生產(chǎn)。目前代謝工程在微生物合成萜類化合物、聚羥基脂肪酸酯、氨基酸、生物燃料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。大腸桿菌因其易于培養(yǎng)、遺傳背景清楚、遺傳操作簡便等優(yōu)點(diǎn)被大規(guī)模應(yīng)用于代謝工程改造合成各種有用的化合物。利用

8、大腸桿菌以廉價(jià)碳源發(fā)酵合成N－乙酰神經(jīng)氨酸的報(bào)道非常少。在本論文中，我們在大腸桿菌中設(shè)計(jì)了一條N－乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵途徑，以葡萄糖為碳源合成N－乙酰神經(jīng)氨酸，為微生物發(fā)酵產(chǎn)生N－乙酰神經(jīng)氨酸提供了新的思路。
　　 過量表達(dá)來自于Escherichia coli W3110的N－乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、來自于Synechocystis sp.PCC6803的N－乙酰葡萄糖胺－2－異構(gòu)酶，以及來自于Saccharomyces cerev

9、isiae EBY100的葡萄糖胺－6－磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶，構(gòu)建了一條以N－乙酰葡萄糖胺－6－磷酸為中間產(chǎn)物的N－乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑。將這一代謝途徑轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，發(fā)酵獲得少量N－乙酰神經(jīng)氨酸。通過實(shí)時(shí)定量PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)前體物N－乙酰葡萄糖胺合成途徑的第一個(gè)酶葡萄糖胺－6－磷酸合酶基因表達(dá)量低，且此前研究表明該酶受其產(chǎn)物的反饋抑制，因此我們過量表達(dá)解除反饋抑制的葡萄糖胺－6－磷酸合酶基因，提高了N－乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。

10、　　 通過阻斷N－乙酰葡萄糖胺分解代謝支路，在大腸桿菌中檢測到N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰甘露糖胺的積累，但N－乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量僅略有提高。分析重組菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)乙酸是主要副產(chǎn)物。乙酸有兩個(gè)主要來源：乙酰輔酶A經(jīng)過磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶的催化生成乙酸；丙酮酸經(jīng)丙酮酸氧化酶直接催化生成乙酸。乙酸的產(chǎn)生造成丙酮酸的浪費(fèi)并且引起培養(yǎng)基pH下降，抑制菌體生長。敲除乙酸的兩個(gè)主要產(chǎn)生途徑，在發(fā)酵產(chǎn)物中同時(shí)檢測到丙酮酸和N－乙酰葡萄糖胺的積

11、累，并且N－乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量得到提高。在培養(yǎng)基中還檢測到另一副產(chǎn)物乳酸的積累，敲除該支路后N－乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。大腸桿菌可以以N－乙酰神經(jīng)氨酸為唯一碳源生長，我們阻斷了N－乙酰神經(jīng)氨酸的再利用途徑，獲得一株可以有效合成N－乙酰神經(jīng)氨酸的重組菌株。將這一重組菌株進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得到7.85 g/l N－乙酰神經(jīng)氨酸，說明該菌株具有工業(yè)應(yīng)用潛力。在發(fā)酵過程中還檢測到有丙酮酸、N－乙酰甘露糖胺和N－乙酰葡萄糖胺，這些副產(chǎn)物在葡

12、萄糖代謝完之后可以繼續(xù)轉(zhuǎn)化為N－乙酰神經(jīng)氨酸。
　　 我們嘗試了多種策略以改善發(fā)酵過程中N－乙酰葡萄糖胺積累較多這一現(xiàn)象。通過過量表達(dá)N－乙酰葡萄糖胺向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，或者將N－乙酰葡萄糖胺合成基因在低拷貝質(zhì)粒上表達(dá)，都可以引起胞外N－乙酰葡萄糖胺的量下降，但是N－乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量也隨之降低。在發(fā)酵過程中添加表面活性劑以增加N－乙酰神經(jīng)氨酸向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表面活性劑的添加引起菌體不同程度死亡，葡萄糖代謝能力下降或喪失，N