N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅴ表達(dá)受阻引起細(xì)胞ER stress的研究.pdf

1、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V)是存在于高爾基體中的N糖鏈外鏈加工酶，催化UDP-GlcNAc中GlcNAc轉(zhuǎn)移到N糖鏈五糖核心上α甘露糖(aman)形成β1，6鍵，是合成C2C2，6型三天線和C2，4C2，6型四天線N糖鏈所必需的，細(xì)胞表面β1，6分支結(jié)構(gòu)的多少主要取決于GnT-V活性及表達(dá)的高低。大量研究表明腫瘤細(xì)胞侵襲很大程度上是由于細(xì)胞表面形成過量的N糖鏈β1，6分支結(jié)構(gòu)所致，過多的β1，6分支結(jié)構(gòu)導(dǎo)致生成多天線的N糖鏈

2、結(jié)構(gòu)改變了糖蛋白分子的生物學(xué)性狀，使腫瘤細(xì)胞粘附功能發(fā)生異常而易發(fā)生向周圍組織侵襲。本教研室以往的研究發(fā)現(xiàn)用反義核酸技術(shù)阻斷體外培養(yǎng)H7721人肝癌細(xì)胞的GnT-V基因表達(dá)，建立了GnT-V基因沉默細(xì)胞株GnT-V-AS／H7721，并且觀察到由于GnT-V基因沉默而引起的細(xì)胞表型改變，例如生長緩慢，對血清饑餓耐受下降，對凋亡誘導(dǎo)劑全反式維甲酸(ATRA)更加敏感等。為探討其機(jī)制用基因芯片技術(shù)(DNAmicroarray)對H7721細(xì)

3、胞和GnT-V-AS／H7721細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GnT-V-AS／HH7721細(xì)胞基因表達(dá)譜具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)的特征。ERstress是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白堆積到一定程度引起的一種真核細(xì)胞應(yīng)激現(xiàn)象，是近年來新發(fā)現(xiàn)的重要的凋亡起始機(jī)制之一，目前國外對ERstress的研究報(bào)導(dǎo)較多，國內(nèi)尚未見研究成果報(bào)導(dǎo)。本文以H7721細(xì)胞為材料從分子水平對GnT-V表達(dá)受阻后引起ERstress的現(xiàn)象進(jìn)行了較為系統(tǒng)

4、的研究并探討其產(chǎn)生機(jī)制。 一．GnT-~-AS／H7721和H7721細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況的總體比較 本文運(yùn)用基因芯片技術(shù)對GnT-V-AS／H7721和H7721細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)進(jìn)行檢測和比較，結(jié)果表明GnT-V-AS／H772l細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平具有以下特點(diǎn)：(1)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊的伴侶蛋白如BIP、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酰肽酰異構(gòu)酶D和A以及一些熱休克蛋白表達(dá)上調(diào)為H7721細(xì)胞的3倍以上，其中BIP

5、更上調(diào)為8．21倍，(2)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的一些基因表達(dá)下降，如S5、S10、S14、S19、S21、L8、L10、L18、L27、L29、L37的表達(dá)僅為H7721細(xì)胞的0．11一O．45，(3)涉及泛肽和蛋白酶體的蛋白降解途徑的基因表達(dá)上調(diào)，如泛肽水解酶，E2．泛肽結(jié)合酶，蛋白酶體亞基P40,P55,HC3,HC8,HC9表達(dá)為H7721細(xì)胞的2．6—6．6倍。通過復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，表明這些現(xiàn)象符合近年來才發(fā)現(xiàn)的，普遍存在于真核細(xì)胞中的ERs

6、tress現(xiàn)象，因此推測GnT-V表達(dá)受阻可能是GnToV-AS／H7721細(xì)胞產(chǎn)生ERstress的起始原因。 二．GnT-V-AS／H7721和H7721細(xì)胞ERstress過程中的關(guān)鍵信息分子的檢測比較 為驗(yàn)證GnT-V-AS／H7721細(xì)胞株存在ERstress現(xiàn)象，本文以GnT-V-AS／H7721細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，H7721細(xì)胞和二巰基蘇糖醇(DTT)處理的H7721細(xì)胞作為陰性和陽性對照，檢測ERstress

7、過程中的關(guān)鍵分子的表達(dá)。ERstress過程中的關(guān)鍵分子主要有BIP、XBPl和PERK等，其中伴侶蛋白BIP是ERstress信號傳導(dǎo)過程中最終上調(diào)的靶目標(biāo)，其表達(dá)上調(diào)是公認(rèn)的細(xì)胞發(fā)生ERstress標(biāo)志。轉(zhuǎn)錄因子XBPl是哺乳動物細(xì)胞ERstress信號傳導(dǎo)過程中的中樞性調(diào)節(jié)分子，細(xì)胞發(fā)生ERstress時(shí)其mRNA發(fā)生特異性地剪接。PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的elF2ct蛋白激酶家族成員，細(xì)胞發(fā)生ERstress時(shí)特異性地發(fā)生活化，并通

8、過磷酸化翻譯起始因子elF20~而下調(diào)細(xì)胞蛋白合成水平。對這三種ERstress關(guān)鍵分子的檢測發(fā)現(xiàn)：和陰性細(xì)胞相比較，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中BIP的表達(dá)無論是蛋白水平還是轉(zhuǎn)錄水平都有明顯的上調(diào)，但上調(diào)程度都要低于DTT處理的ERstress陽性細(xì)胞；XBP一1mRNA在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中部分被剪接，在陽性細(xì)胞中XBP．1mRNA完全被剪接，而在陰性細(xì)胞中其以非剪接形態(tài)存在；此外和DTT處理的ERstress陽性細(xì)胞相似，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的PERK發(fā)生磷酸化，表明

9、ERstress過程中通過磷酸化elF2a抑制蛋白合成機(jī)制的活化，這和芯片所檢測到的GnT-V-AS／H7721細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)水平下調(diào)相一致。這些結(jié)果表明GnT-V-AS／H7721細(xì)胞中存在有ERstress現(xiàn)象，并且相對于DTT引起的ERstress程度較輕，可能是慢性的ERstress過程。因有研究表明非特異性的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞可以激活胞內(nèi)蛋白激酶PKR而引起elF2a磷酸化，抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。GnT-V-AS／H772

10、1中含有整合的反義GnT-VcDNA，并且通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA與GnT-V的mRNA結(jié)合而起作用，反義GnT-VcDNA的整合也有可能作為非特異因素，為排除整合及雙鏈RNA原因?qū)е碌姆翘禺愐蛩馗蓴_，采用了反義寡聚核苷酸(asODN)技術(shù)阻斷H7721細(xì)胞中GnT-V的表達(dá)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIP的表達(dá)同樣發(fā)生上調(diào)，并且出現(xiàn)少量的剪接XBP一1mRNA，這表明GnT-V表達(dá)受阻可以特異性地引起胞內(nèi)ERstress。本教研室以往的研究發(fā)現(xiàn)GnT

11、-V-AS／H7721細(xì)胞相對于H7721細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑ATRA更加敏感，而ERstress是引起凋亡的重要因素之一，當(dāng)刺激信號過于劇烈，細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)答仍不足以克服過強(qiáng)的刺激信號導(dǎo)致的細(xì)胞損傷時(shí)，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿側(cè)的caspasel2能特異地被激活并參與ERstress引起的凋亡過程，本文發(fā)現(xiàn)ATRA處理的GnT-V-AS／H7721細(xì)胞中存在caspasel2活化，表明GnT-V-AS／H7721細(xì)胞對ATRA誘導(dǎo)的凋亡敏感性的增高和

12、胞內(nèi)的ERstress有關(guān)。 三．GnT-V-AS／H7721和H7721細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成及胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的比較 GnT-V表達(dá)受阻可以特異性地引起細(xì)胞發(fā)生ERstress，但GnT-V是高爾基體中的N糖鏈外鏈加工酶，并不參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈的合成及蛋白折疊過程。通過相關(guān)文獻(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)直接參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成及蛋白折疊的酶和伴侶蛋白大多數(shù)是有N糖鏈的糖蛋白，GnT-V表達(dá)受阻后胞內(nèi)N糖鏈外鏈加工

13、方式的改變可能導(dǎo)致它們N糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而正確的糖鏈結(jié)構(gòu)是糖蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能所必需的，因此考慮GnT-V表達(dá)受阻后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)N糖鏈合成酶和伴侶蛋白功能的異常是導(dǎo)致細(xì)胞ERstress的原因之一。為了研究GnT-V表達(dá)受阻對細(xì)胞N糖鏈合成的影響，本文以GnT-V-AS／H7721細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，H7721細(xì)胞和衣霉素(tunicamycinTM)處理H7721細(xì)胞作為對照，以3H_甘露糖摻入法研究三種細(xì)胞株糖蛋白N糖鏈合成的差異，結(jié)果發(fā)

14、現(xiàn)GnT-V-AS／H7721細(xì)胞和陽性對照相似，二者糖蛋白N糖鏈合成分別下降為H7721細(xì)胞的56％和26％，證明GnT-V表達(dá)受阻后可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中糖蛋白N糖鏈合成，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N糖鏈合成酶功能發(fā)生下降，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈糖蛋白糖基化異常而引起細(xì)胞發(fā)生ERstress。為了檢測了GnT-V表達(dá)受阻后胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，同樣以三種細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對象，在去除細(xì)胞膜表面糖肽后，用HRP標(biāo)汜的刀豆凝集素(ConA)和蔓陀羅凝集素(

15、DSA)分析胞內(nèi)糖蛋白的N糖鏈結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GnT-V-AS／H7721細(xì)胞相對于H7721細(xì)胞對HRP-ConA染色增深，而對HRP-DSA染色變淺，表明GnT-V表達(dá)受阻后胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈β1，6-GlcNAc分支結(jié)構(gòu)含量減少，說明細(xì)胞內(nèi)糖蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)因GnT-V表達(dá)受阻而普遍發(fā)生改變，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成酶及伴侶蛋白的N糖鏈結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，因此認(rèn)為GnT-V表達(dá)受阻可能影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N糖鏈合成酶和伴侶蛋白的N糖鏈結(jié)構(gòu)，從而影響