N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶在腎細(xì)胞癌中表達(dá)及作用的研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC，簡(jiǎn)稱腎癌) 是泌尿外科最常見(jiàn)的腫瘤之一。患者早期一般無(wú)臨床癥狀，出現(xiàn)典型臨床癥狀時(shí)往往腫瘤體積已較大或發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時(shí)腫瘤細(xì)胞常累及包膜，侵入腎盂或侵及腎周組織，如腎上腺、脾、肝等，也可經(jīng)淋巴或血行轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)或腎靜脈、下腔靜脈、主動(dòng)脈形成癌栓，遠(yuǎn)處常轉(zhuǎn)移至肺、骨骼。因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期手術(shù)根治以及術(shù)后的隨訪監(jiān)測(cè)對(duì)患者的生存和預(yù)后非常重要。然而，目前臨床上尚缺乏可實(shí)際應(yīng)用的、特異

2、性和敏感性高的可作為腎癌侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)記的生化指標(biāo)。 已知糖鏈與腫瘤的關(guān)系十分密切。腫瘤的發(fā)生通常與細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)糖蛋白的糖鏈在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中可發(fā)生多種不同的結(jié)構(gòu)變化，而蛋白質(zhì)部分的結(jié)構(gòu)則基本不變。由于腎癌組織中N-糖鏈分支的糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)是降低或不變的，我們推測(cè)腎癌轉(zhuǎn)移可能與O-糖鏈密切有關(guān)。但目前對(duì)于腎癌細(xì)胞表面O-糖鏈改變的研究未見(jiàn)報(bào)道。 O-糖鏈的起始糖基化(催化O-糖鏈合成的第一步)是由多

3、肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化的，簡(jiǎn)稱為pp-GalNAc-T，是決定糖蛋白中O-糖基化的關(guān)鍵酶。此酶將GalNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)多肽鏈上特定序列中的絲氨酸或蘇氨酸，從而合成GalNAc多肽。由于pp-GalNAc-T有不同的組織分布和對(duì)肽鏈序列的不同專一性，即在不同的組織中pp-GalNAc-T1～T亞型的表達(dá)量和對(duì)底物的催化效率是不同的。 我們?cè)?jīng)參與克隆的人pp-GalNAc-T14新基因在正常組織中，僅在腎臟有特異性

4、的高表達(dá)，而在腎癌中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于N-糖鏈分支和唾液酸Lewis抗原的表達(dá)和腎癌轉(zhuǎn)移關(guān)系不明顯，從而設(shè)想O-糖鏈參與腎癌轉(zhuǎn)移的可能性，pp-GalNAc-T是O-糖鏈的限速酶，因此，pp-GalNAc-T14在正常人腎細(xì)胞的糖鏈形成中起了至關(guān)重要的作用。所以，本研究選擇pp-GalNAc-T14作為目標(biāo)，研究其在腎癌中的表達(dá)及其與腎癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移作用的關(guān)系。 目的：研究腎癌與糖基化蛋白的關(guān)系，檢測(cè)腎臟特異性的N-乙酰氨基半乳

5、糖轉(zhuǎn)移酶-14(pp-GalNAc-T14)的表達(dá)在腎癌中的改變。 方法：收集20例腎癌患者根治性腎切除標(biāo)本的腎癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織。檢測(cè)pp-GalNAc-T-14的mRNA的表達(dá)，用Trizol提取腎組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，設(shè)計(jì)pp-GalNAc-T-14的引物，用RT-PCR檢測(cè)腎癌組織和對(duì)照正常腎組織中 pp-GalNAc-T-14的mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：腎癌組織和正常腎組織中pp-Ga

6、lNAc-T-14的mRNA均表達(dá)，掃描定量顯示pp-GalNAc-T-14的mRNA的表達(dá)在腎癌組織中較正常腎組織高26.63％，P<0.01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：腫瘤的發(fā)生通常與細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，腎癌轉(zhuǎn)移和細(xì)胞膜糖鏈結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。O-糖鏈的起始糖基化是由pp-GalNAc-T催化的。本實(shí)驗(yàn)中pp-GalNAc-T14的mRNA的表達(dá)在腎癌組織中顯著升高，提示pp-GalNAc-T-14在腎癌中的表達(dá)與腎癌發(fā)

7、生有密切的關(guān)系。 第二部分冬凌草甲素對(duì)腎癌細(xì)胞的抑制及其作用機(jī)理的研究 目的：了解冬凌草甲素對(duì)。腎癌細(xì)胞在體外的殺傷抑制作用，同時(shí)檢測(cè)腎癌細(xì)胞在藥物作用前后pp-GalNAc-T-14的mRNA表達(dá)情況的變化。 方法：腎癌細(xì)胞系(786-0細(xì)胞株)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，用單四唑(MTT)法觀察冬凌草甲素對(duì)該細(xì)胞系的抑制殺傷效果，進(jìn)而運(yùn)用RT-PCR 檢測(cè)pp-GalNAc-T-14的mRNA的表達(dá)。

8、結(jié)果：冬凌草甲素可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，隨著冬凌草甲素劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制細(xì)胞增殖作用逐漸增強(qiáng)，呈明顯的時(shí)間劑量依賴性。16μmol/L 的冬凌草甲素引起的生長(zhǎng)抑制明顯高于8μmol/L 的抑制率(P<0.01)，最高可達(dá)90％以上。冬凌草甲素作用于786-0細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞中pp-GalNAc-T14表達(dá)較空白對(duì)照組24小時(shí)下降15.98％、48小時(shí)下降44.30％、72小時(shí)下降58.61％，P<0.01