人源N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(OGT)的原核表達及活性研究.pdf

1、O-GlcNAc是一種廣泛存在于蛋白質絲/蘇氨酸殘基上的一種動態(tài)、可逆的蛋白翻譯后修飾,它主要分布在細胞漿和細胞核中,參與調解許多細胞途徑。近年來的一些研究已經證明O-GlcNAc的異常與神經退行性疾病、糖尿病等疾病相關。O-GlcNAc修飾是由O-連接N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(OGT)和O-連接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)協(xié)同完成的,所以對OGT進行深入研究意義重大。
　　 OGT是一個分子量比較大的蛋白,所以要在體外表達

2、OGT比較困難。利用分子生物學實驗方法,我們成功地將mOGT、ncOGT以及mOGT的截短型基因片段克隆到原核表達載體pET-21a(+)上,獲得重組質粒pET21/mOGT、pET21/ncOGT、pET21/mOGT(3TPR)和pET21/mOGT(5TPR),轉入BL21(DE3)中進行表達。我們在低溫條件下誘導出了少量的mOGT,以及大量的mOGT(3TPR)和mOGT(5TPR)蛋白。依次用鎳柱親和層析和分子篩純化蛋白,我們

3、得到了純度高達85％的mOGT(5TPR)蛋白,并通過Wegem blot檢驗到純化得到的蛋白具有OGT免疫學特異性。
　　 OGT蛋白含有兩個功能結構域,氨基端的三十四肽重復序列(tetratricopeptiderepeat,TPR)和羧基端的催化結構域。TPR結構主要參與OGT的底物識別,不同長度的TPR結構具有不同的識別能力,有研究表明隨著TPR長度的減少,其結合大分子底物的能力會減弱,但其對小分子多肽的結合能力會增加。

4、故我們就以人工合成的九肽為底物檢測了體外表達的mOGT(5TPR)蛋白的酶活。
　　 我們創(chuàng)新性的發(fā)展了一種檢測OGT活性的新方法:酶偶聯法。這種方法主要是通過檢測轉糖基反應中UDP的生成量來檢測OGT活性的。這種方法的主要原理是:UDP和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在丙酮酸激酶的作用下轉化成丙酮酸,然后通過商品化的丙酮酸檢測試劑盒來檢測丙酮酸的生成量,在試劑盒的作用下丙酮酸會轉化成一種在570 nm處有紫外吸收的紅色產物,然后通

5、過沒標儀讀取數值。通過對mOGT(5TPR)的進行酶學常數研究,我們得到mOGT(5TPR)對L5DP-GlcNAc和九肽的Km值分別是0.17mM和0.16mM,說明OGT對UDP-GlcNAc和九肽有相同的親和力。并且OGT對UDP-GlcNAc的Km值與文獻報道的60μM在同一水平。
　　 總之,我們成功的構建了OGT的原核表達菌株,并表達純化出高純度,具有一定活性的截短型OGT蛋白。隨后我們發(fā)展了一種檢測OGT活性的新方