N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V通過VE-cadherin及β1整合素介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)的覆蓋在在全身血管內(nèi)膜上，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能除了是血液和組織的屏障，還具有其他多種功能，如降低血管通透性，調(diào)節(jié)血液與組織的物質(zhì)交換，減少無序侵入的血漿成分和血液細(xì)胞的數(shù)量；通過合成和分泌相關(guān)因子調(diào)節(jié)血管平滑肌功能；抑制白細(xì)胞的游走和侵入。鑒于這些生理功能，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是諸如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等一系列疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制為心血管疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。本文主要探討血管內(nèi)皮

2、細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)生變化時(shí)，存在著調(diào)控VE-cadherin，β1整合素的糖基化“開關(guān)”。這種作用有可能是通過GnT-V催化作用進(jìn)而分配VE-cadherin，β1整合素上N-glycans的豐度影響內(nèi)皮細(xì)胞功能。
　　第一部分：N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V通過粘附分子VE-cadherin調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附
　　本研究首先運(yùn)用THP-1單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附實(shí)驗(yàn)確定IL-1β促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的最佳時(shí)間

3、點(diǎn)和濃度點(diǎn)。其次通過Western blot及Lectin blot檢測發(fā)現(xiàn)，IL-1β(1μg·L-1，5μg·L-1，25μg·L-1)處理EA.hy926細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞中GnT-V蛋白及β1-6GlcNAc糖支鏈的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞中總VE-cadherin蛋白水平上調(diào)。同法IL-1β(5μg·L-1)處理EA.hy926細(xì)胞后，采用免疫共沉淀法檢測VE-cadherin上β-1，6GlcNAc糖支鏈的變化，發(fā)現(xiàn)IL-1β可

4、使VE-cadherin上β-1，6GlcNAc糖支鏈結(jié)構(gòu)減少。另外，研究發(fā)現(xiàn)隨著IL-1β(1μgL-1，5μg·L-1，25μg·L-1)濃度增加，VE-cadherin復(fù)合物中β-catenin大量與其脫離。為了深入探索研究Gnr-V在內(nèi)皮細(xì)胞中對VE-cadherin復(fù)合物的影響，通過細(xì)胞中GnT-V基因敲除和過表達(dá)正反兩個(gè)方面闡述GnT-V作用的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)GnT-V下調(diào)或上調(diào)，β-1，6GlcNAc糖支鏈相應(yīng)隨著變

5、化；同時(shí)，VE-cadherin，VE-cadherin上β-1，6GlcNAc糖支鏈的變化相應(yīng)隨之減少或增加。另外，β-catenin從VE-cadherin復(fù)合物上脫落的量也相應(yīng)的增加或減少，THP-1單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)。為了驗(yàn)證IL-1β能夠通過影響GnT-V進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，在GnT-V過表達(dá)后加入IL-1β(5μg·L-1)處理，與GnT-V過表達(dá)結(jié)果恰好相反。綜上表明：GnT-V可能通過改變細(xì)胞中VE-cadh

6、erin上β-1，6GlcNAc糖支鏈進(jìn)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，炎癥因子IL-1β可能通過影響GnT-V導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　第二部分：IL-1β通過β1整合素糖基化修飾誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡
　　IL-1β是白細(xì)胞介素1細(xì)胞因子家族的成員之一，是最重要的炎癥細(xì)胞因子之一，它介導(dǎo)了炎癥的重要過程，已有研究顯示IL-1β可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。認(rèn)清這種細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制，將會(huì)為動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制提供較

7、好的理論依據(jù)。為了探討IL-1β對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制，以EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，利用不同濃度IL-1β刺激24 h，采用Western blot方法檢測IL-1β對β1整合素，Bc1-2，Bax，Caspase-3及N-乙酞氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移-V(GnT-V)表達(dá)的影響；通過Lectin blot方法顯示IL-1β對GnT-V所修飾的所有糖蛋白量的影響；免疫共沉淀方法檢測IL-1β對β1整合素糖基化修飾量的變化；流式細(xì)胞術(shù)