N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其殼聚糖納米材料固定化酶抗細(xì)菌生物被膜作用研究.pdf

1、細(xì)菌生物被膜是指由細(xì)菌和由細(xì)菌自身所分泌的包裹著細(xì)菌的胞外基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落,其中胞外多糖(EPS)作為基質(zhì)的主要成分之一參與了細(xì)菌的初始粘附,成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)形成等。研究表明,金黃色葡萄球和表皮葡萄球菌生物被膜中重要多糖成分是β-1,6-N-乙酰氨基葡糖胺。實(shí)驗(yàn)室先期研究中發(fā)現(xiàn)的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Nag1,可以專一降解β-1,6-N-乙酰氨基葡糖胺。本文系統(tǒng)研究了Nag1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(主要是葡萄球菌)生物被

2、膜形成的作用,并利用羧甲基殼聚糖(carboxymethyl-chitosan,CMCS)納米材料對(duì)酶進(jìn)行固定化,研究了固定化酶的相關(guān)性質(zhì)。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先利用多種體外生物被膜模型,包括96孔靜態(tài)模型、flow cell動(dòng)態(tài)模型,并以臨床常用氯乙烯導(dǎo)管、氯乙烯膜片和導(dǎo)尿管為材料構(gòu)建了相關(guān)的模型,評(píng)價(jià)了Nag1對(duì)細(xì)菌生物被膜形成的作用。實(shí)驗(yàn)表明,在96孔板模型中Nag1對(duì)9種葡萄球菌的生物被膜形成均有抑制效果。當(dāng)Nag1的終濃度

3、為0.3 U/mL時(shí),其對(duì)生物被膜形成的抑制率達(dá)到80％以上。同樣,在flow cell和氯乙烯導(dǎo)管模型中,Nag1也能顯著抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。在臨床使用的氯乙烯膜片與導(dǎo)尿管等模型中,Nag1對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜形成的抑制率分別達(dá)到76％和72％。
　　 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明Nag1對(duì)于已形成的細(xì)菌生物被膜亦具有明顯的清除作用,當(dāng)Nag1終濃度達(dá)到0.3 U/mL時(shí),其對(duì)靜態(tài)模型生物被膜的清除率達(dá)到80％以上,而對(duì)于動(dòng)

4、態(tài)模型下的生物被膜清除率則達(dá)90％以上。Nag1對(duì)形成于醫(yī)用材料氯乙烯膜片與導(dǎo)尿管上的生物被膜清除效果分別為79％和76％。
　　 細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的物理屏障,為了確定Nag1是否能增強(qiáng)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的抗生素敏感性,測(cè)定了氨芐青霉素單獨(dú)以及其與Nag1聯(lián)合條件下,不同菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最低殺菌濃度(minimal bactericidal

5、concentration,MBC)及最低生物被膜清除濃度(minimum biofilm eliminating concentration,MBEC)。結(jié)果表明,10株受試菌株形成生物被膜后對(duì)氨芐青霉素的抵抗能力有不同程度的提高(16-512倍),Nag1不能改變浮游菌的抗生素敏感性但是可以增強(qiáng)生物被膜菌的氨芐青霉素敏感性(MBEC降低8-64倍)。
　　 為了檢測(cè)Nag1在動(dòng)物模型上的作用效果,本實(shí)驗(yàn)成功建立了金黃色葡萄球

6、菌小鼠燙傷生物被膜模型并將Nag1作用于感染處,結(jié)果顯示Nag1可有效抑制并清除感染處的生物被膜。Nag1與抗生素聯(lián)用可明顯提高抗生素的作用效果。
　　 由于溶液酶存在穩(wěn)定性差、不能反復(fù)利用等缺陷,本實(shí)驗(yàn)以羧甲基殼聚糖納米粒為載體,研究了Nag1固定化酶的活力并對(duì)影響酶活力的因素包括溫度、儲(chǔ)存穩(wěn)定性等進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,固定化提高了酶的穩(wěn)定性,同時(shí)固定化酶重復(fù)操作8次后,仍有63％的活性,表明固定化酶適于酶的回收與反復(fù)利用

7、。在細(xì)菌生物被膜形成方面,固定化酶對(duì)生物被膜的抑制效果和清除效果均優(yōu)于溶液酶。
　　 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),固定化酶的材料羧甲基殼聚糖本身也具有抗生物被膜效果,因此本文深入研究了羧甲基殼聚糖對(duì)生物被膜的影響。在96孔板模型和動(dòng)態(tài)模型下,CMCS可以有效抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌生物被膜的形成。在初始黏附階段CMCS對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制率均大于90％,而其對(duì)生物被膜菌細(xì)胞與細(xì)胞之間聚集能力的抑制率分別為63％和71％。在作

8、用機(jī)制方面CMCS并不能影響細(xì)菌生長(zhǎng),而是導(dǎo)致細(xì)菌絮凝,其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的絮凝指數(shù)分別為17％和25％。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CMCS對(duì)細(xì)菌絮凝作用是由于CMCS帶有的正電荷中和了細(xì)菌表面的負(fù)電荷,另外推測(cè)CMCS本身的吸附架橋作用也可促進(jìn)絮凝。
　　 綜上所述,Nag1在不同模型中均具有良好的生物被膜形成抑制作用和清除作用;固定化提高了酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)了酶的活力,有利于酶的重復(fù)利用;羧甲基殼聚糖自身亦具有良好的抗細(xì)菌生物