鋸緣青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質(zhì)及活力調(diào)控的研究.pdf

1、以鋸緣青蟹(Scylla serram)內(nèi)臟為材料，通過含0.2 mol/L NaCl的0.01 mol/LTris-HCl(pH 7.5)緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-100凝膠柱過濾層析、DE-32離子交換柱層析，獲得了比活力為7,990 U/mg的電泳單一純N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制劑(NAGase，EC 3.2.1.52)。該酶的等電點為4.68，分子量約為132 kD，每個酶蛋白分子含有約1097個

2、氨基酸殘基，其中非極性占39.1﹪，堿性占7.1﹪，酸性占24.0﹪，極性不帶電荷的占29.8﹪。該酶含兩個分子量約為65.8 kD的同型亞基，肽鏈間不含二硫鍵而肽鏈內(nèi)含有二硫鍵。該酶為糖蛋白，其中含糖量為12.85﹪(w/w)。以對-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)為底物，測得該酶在0.05 mol/LNaAc-HAc緩沖液(pH 5.8)中催化水解pNP-NAG的最適pH為5.6，最適溫度為50℃；該酶在45

3、℃以下，pH 4.6-8.6范圍內(nèi)穩(wěn)定。pH 5.8下，酶水解pNP-NAG的米氏常數(shù)K<,m>為0.424±0.012 mmol/L，最大反應速度V<.max>為17.65±0.32μmol·L<'-1>·min<'-1>，反應的活化能為61.32 KJ/mol。 半胱氨酸的疏基、色氨酸的吲哚基、組氨酸的咪唑基、酸性氨基酸的β-羧基和賴氨酸的ε-氨基是酶的活性功能基團。精氨酸殘基、絲氨酸殘基不是酶的活性所必需。同時，酶分子鏈內(nèi)

4、二硫鍵的形成不是該酶活性所必需。30℃下酶活性中心解離常數(shù)pK<,e>為5.40，解離熱焓△H°為7.812kcal/mol，表明與酶活性有關的可解離基團是組氨酸的咪唑基；產(chǎn)物NAG與產(chǎn)物pNP的類似物苯酚、對羥基苯甲酸對酶的抑制作用表明，酶催化底物pNP-NAG水解反應屬有序雙雙機理。在變性劑鹽酸胍的作用下，酶分子的活力變化快于構(gòu)象的變化，說明酶分子的活性中心處于對胍較敏感的區(qū)域。 養(yǎng)殖水體中富營養(yǎng)化產(chǎn)生的氨態(tài)氮，SP<,3>

5、<'->對酶有較強的抑制作用。水體主要有機污染物苯酚對酶有明顯的抑制作用，與苯酚相比，鄰苯二酚對酶的抑制作用減弱，對苯二酚對酶的抑制作用加強，對羥基苯甲酸的抑制作用最強，這種差異與苯環(huán)上基團的性質(zhì)密切有關。 Cu<'2+>與底物競爭和酶結(jié)合產(chǎn)生抑制，Zn<'2+>對酶的抑制為混合型，zn<'2+>使酶活力的變化快于構(gòu)象的變化，而Cu<'2+>使酶構(gòu)象的變化快于活力的變化。 養(yǎng)殖水體常用消毒藥物中，次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉

6、、三氯異氰尿酸、季氨鹽、聚維酮碘、過氧化氫對酶的活力有不同程度的影響。同時，次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉對酶的抑制作用隨著pH值的升高而減弱，而季氨鹽、聚維酮碘對酶的抑制作用隨著pH值的升高而加強；進一步的活力變化與構(gòu)象變化比較結(jié)果表明，酶活性中心處于對這些消毒藥物較敏感的部位，活力損失快于構(gòu)象的變化。青蟹養(yǎng)殖常用的內(nèi)服、外用抗菌藥物中，磺胺間甲氧嘧啶、氟哌酸、恩諾沙星對酶有明顯的抑制作用，而頭孢拉定對酶有明顯的激活作用。 采用鄒氏