N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V調(diào)控多藥耐藥小細胞肺癌的放射敏感性及機制.pdf

1、一、研究背景
　　 肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一。小細胞肺癌(SCLC)占所有肺癌的15％左右。它的特點是快速增長，早期擴散和和對一線化療或放療顯著敏感。然而，由于治療過程中放化療的耐受，目前三分之二的患者具有高復(fù)發(fā)率，隨后的預(yù)后較差。雖然一些分子如Bmi1、MDR1/ABCB1等與放化療相關(guān)，但它們不能有效地應(yīng)用于臨床。因此，小細胞肺癌的治療仍然具有挑戰(zhàn)性，靶向與耐受相關(guān)的更有效的治療的研究是必要的。
　　 細

2、胞表面糖蛋白的異常糖基化與很多人類腫瘤高度相關(guān)。位于高爾基體內(nèi)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在糖蛋白的合成中起關(guān)鍵作用。N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosaminyltransferases，GnTs)至少有6種，分別是GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ、GnT-Ⅲ、GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和GnT-Ⅵ。N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-Ⅴ(N-acetylglucosaminyltransferaseⅤ，GnT-Ⅴ)是目前研究最多的，是多支N鏈糖蛋

3、白合成過程的關(guān)鍵酶。研究顯示，GnT-Ⅴ催化在N-聚糖的B1，6乙酰葡萄糖酰胺分支，通過促進細胞增殖，抑制細胞凋亡等與細胞的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。在一些研究中，探索了治療耐受性和N-聚糖之間的關(guān)系。例如，用衣霉素抑制N鏈糖蛋白合成提高了人頭頸部腫瘤細胞對順鉑的敏感性。人類膠質(zhì)母細胞瘤細胞株表面蛋白糖基化的改變可降低耐藥。我們的實驗室曾報道下調(diào)GnT-Ⅴ后人鼻咽癌CNE-2細胞在體外和體內(nèi)的放射敏感性增強。然而，GnT-Ⅴ在多藥耐藥的(multi

4、drug resistant，MDR)小細胞肺癌細胞中的放射耐受的作用還不清楚。
　　 為了進一步研究GnT-Ⅴ在MDR小細胞肺癌中放射耐受的作用，建立了低表達GnT-Ⅴ的SCLC亞系細胞（H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69AR GnT-Ⅴ/2224）。研究表明下調(diào)GnT-Ⅴ顯著提高了小細胞肺癌細胞對藥物和放射的敏感性。此外，NF-κB和凋亡相關(guān)分子參與了GnT-Ⅴ調(diào)控放射抵抗性。這些結(jié)果表明，GnT-Ⅴ可能是小細胞肺癌放

5、化療抵抗性的一個潛在的靶點。
　　 二、研究目的
　　 1.本實驗選擇人小細胞肺癌細胞株H446、H69與其多藥耐藥細胞株H69AR作為研究對象，分析細胞對放化療敏感性的差異。
　　 2.分析小細胞肺癌細胞株H69AR、H69與H446在蛋白水平GnT-Ⅴ表達的差異，研究GnT-Ⅴ是否參與多藥耐藥小細胞肺癌細胞株的放射耐受。
　　 3.運用shRNA將高表達GnT-Ⅴ的H69AR細胞株中的GnT-Ⅴ進行沉

6、默后，檢測沉默效果，觀察H69AR細胞株放化療敏感性的變化。
　　 4.闡明在多藥耐藥小細胞肺癌H69AR細胞的放射耐受中GnT-Ⅴ的作用和其潛在的機制。
　　 三、實驗方法
　　 3.1細胞系和細胞培養(yǎng)
　　 人的小肺癌細胞株NCI-H446，NCI-H69和耐藥亞系NCI-H69AR均購自美國ATCC細胞庫。H69細胞懸浮聚集生長，傳代通過輕輕機械吹打均勻按適當(dāng)比例稀釋后分裝至新培養(yǎng)瓶中;而H69AR

7、或H446單層貼壁生長，需要使用含0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶消化傳代。所有細胞均常規(guī)培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS)（H69AR培養(yǎng)基含20％胎牛血清;H69和H446細胞株培養(yǎng)基含10％胎牛血清）和谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃5％ CO2的孵箱中培養(yǎng)。高表達MRP1/ABCC1的H69AR用不含和含0.8μM阿霉素(ADM)的培養(yǎng)基交替培養(yǎng)。用藥物定期檢查耐藥株H69AR的耐藥性。每周監(jiān)測所有細胞的形態(tài)和生長

8、狀態(tài)。
　　 3.2 CCK-8法檢測藥物和放射敏感性
　　 通過細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)測定化療或放療引起的效應(yīng)。抗癌藥物阿霉索(ADM，中國深圳)，順鉑（DDP，中國山東）和依托泊苷(VP-16，中國江蘇)根據(jù)說明書溶解，用5個濃度測試。藥物的濃度范圍基于以前的研究，旨在獲得高度敏感和耐藥細胞的IC50值（導(dǎo)致50％生長抑制的藥物濃度）。通過直線加速器（Clinac2300C/D，美國）給予6mV X射線放射細胞

9、。用CCK-8水溶性四唑鹽-WST(@)-8[2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽]定量抗癌藥物或放射誘導(dǎo)的細胞死亡。根據(jù)各個藥物濃度或不同照射劑量下細胞存活率，作存活曲線，得到藥物IC50值和放射敏感性曲線。細胞存活率=（處理組平均OD值-空白組平均OD值）/（非處理組陽性對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100％。
　　 本試驗按照下述步驟進行。消化細胞，重懸，調(diào)

10、整細胞濃度為1×105/ml，按100μL/孔接種于96孔板中（104/孔），設(shè)空白對照孔。鋪板后放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，將化療藥物ADM、DDP、VP-16加入培養(yǎng)基中并進行倍比稀釋，按不同濃度分別加入指定的孔中，并設(shè)不加藥物的陽性對照孔?；蛞?Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy放射細胞。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入CCK-8反應(yīng)液，在37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)2h后在酶標儀上測450nm吸光度。測得的每個藥

11、物濃度或放射劑量的OD值。進行3次獨立平行實驗，每次實驗含3個復(fù)孔。
　　 3.3 pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
　　 pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA從上海吉瑪公司獲得。按以前的文獻分別構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ/1564（反義GnT-Ⅴ基因質(zhì)粒），pGPU6/GFP/NeoGnT-Ⅴ/2224（反義GnT-Ⅴ基因質(zhì)粒），pGPU6/GFP/Neo

12、GnT-Ⅴ/NC（對照質(zhì)粒）;構(gòu)建和鑒定低表達GnT-Ⅴ的小細胞肺癌亞株(H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69ARGnT-Ⅴ/2224)和對照的轉(zhuǎn)染細胞株(H69AR GnT-Ⅴ/NC)，具體方法參見文獻。
　　 3.4裸鼠皮下成瘤及分次放射實驗
　　 BALB/C nu/nu裸鼠均為雄性，4-6周齡，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，并飼養(yǎng)于中山大學(xué)SPF級試驗室。動物實驗按照中山大學(xué)倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。
　　

13、 選擇H69AR、H69、H446和口H69AR GnT-Ⅴ/NC、H69AR GnT-Ⅴ/1564、H69ARGnT-Ⅴ/2224組細胞擴大培養(yǎng)，用于皮下注射。用PBS重懸細胞，調(diào)整其濃度為5×107個/ml，每組接種200μl癌細胞懸液于左臀部皮下。注射后用卡尺定期測量瘤體的短徑和長徑，瘤體體積=（短徑2×長徑）/2;裸鼠移植瘤生長14天（腫瘤體積大約300mm3）后進行下一步的實驗。分次放射按以前文獻所述的進行，標化瘤體體積=放

14、射第X瘤體體積/同組中放射第0瘤體體積。12天后（總劑量10Gy的照射完成2天后），斷頸處死裸鼠，剝離瘤體，固定，石蠟包埋切片，進行HE染色檢測;Western Blot法檢測組織中Bcl-2、Bcl-xl和Bax蛋白表達水平變化。
　　 3.5細胞周期檢測
　　 為了分析細胞周期分布，X線放射(0Gy，6Gy)后24小時收集細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次，然后用70％冷乙醇固定12小時。PBS重懸細胞，調(diào)整細

15、胞濃度至106/ml。用PBS洗滌后，將細胞用含核糖核酸酶的PBS處理。接下來，DNA用碘化丙啶(PI)冰上染色30分鐘，通過流式細胞儀分析細胞周期（BD Biosciences，英國）。實驗重復(fù)3次。
　　 3.6細胞凋亡檢測
　　 Hoechst33258-染色觀察凋亡形態(tài)，細胞接種在24孔板生長至單層，0Gy、6Gy放射后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，吸盡培養(yǎng)液，用冷PBS洗兩遍，加入0.5ml的4％甲醛固定液，4℃固定10分

16、鐘，去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體，加入0.5ml Hoechst33258染色液，室溫避光染色10分鐘，去染色液，用PBS洗三遍，吸盡液體。熒光顯微鏡下觀察和拍攝細胞凋亡形態(tài)。
　　 0Gy、6Gy放射細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書用流式細胞儀檢測和分析細胞凋亡率。
　　 0Gy、6Gy放射細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)原位細胞凋亡檢

17、測試劑盒，按試劑盒說明進行TUNEL實驗，檢測細胞凋亡時的特征性DNA鏈斷裂。熒光顯微鏡下觀察，隨機選5個視野計數(shù)處理或轉(zhuǎn)染細胞中TUNEL陽性的細胞。
　　 利用特異底物通過比色法檢測Caspase-3的活性。待細胞貼壁后接受X線(0Gy、6Gy)放射后24小時。胰酶消化離心收集待測細胞，重懸細胞，冷PBS洗一次。加入細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育10分鐘。裂解液16，000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清于檢測緩沖液中測定Caspase

18、-3活性;加入Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA37℃孵育1小時。然后用分光光度計測定在405nm的吸光值。通過比較放射組和相應(yīng)的對照組的吸光值來檢測Caspase-3活性的增加。
　　 3.7雙螢光素酶報告基因檢測NF-κB活性
　　 為確定放射或GnT-Ⅴ抑制在放射誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，細胞接種到24孔板24小時后長滿70-80％參照Lipofectamine2000（Invitrogen，美國）說明書

19、，共轉(zhuǎn)染pNF-κB-Luc和pRL-CMV（由澳大利亞墨爾本彼得·麥卡勒姆癌癥中心的轉(zhuǎn)移研究實驗室饋贈）到待測細胞中。轉(zhuǎn)染24小時后，0Gy、6Gy放射細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞，裂解后檢測熒光素酶的活性確定NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶活性檢測使用的試劑盒為Dual-Luciferase Reporter AssaySystem（Promega，美國）。Berthold Lumat LB9507化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測螢光素酶活性。<

20、br>　　 3.8細胞免疫熒光
　　 0Gy、6Gy放射細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。NF-κB p65、Cy3標記的二抗染色待測細胞，DAPI染核。通過萊卡DMIRE2熒光顯微鏡（Leica，德國）觀察和拍照染色細胞。分別拍攝Cy3標記染色的NF-κB p65和DAPI染核的圖片，再將兩張圖片重疊組合。
　　 3.9Westem Blot分析
　　 X線(0Gy，6Gy)放射細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞(107

21、)。加入蛋白裂解液提取蛋白，用標準的BCA方法（BCATM蛋白檢測試劑盒，美國）測定蛋白濃度。取蛋白樣品和上樣緩沖液，離心混合后煮沸5min，離心后吸取依次上樣，同一實驗不同上樣孔之間蛋白含量相等（20μg/孔）。10％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，并半干電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5％脫脂奶粉37℃封閉PVDF膜2小時。一抗（Bcl-2、Bax一抗稀釋濃度為1∶200，Bcl-xl稀釋濃度為1∶30

22、0，均購自美國Santa Cruz公司;GAPDH蛋白單克隆抗體稀釋濃度1∶1000，購自中國Abmart公司）與PVDF膜4℃孵育12小時，TBST（10mM Tris，pH值8.0，150mM NaCl和0.1％吐溫20）洗膜。通過與辣根過氧化物酶標記的二抗（抗體稀釋濃度1∶4000，購自北京博奧森生物科技有限公司）室溫孵育45分鐘，再次洗滌。增強化學(xué)發(fā)光(enhancedchemiluminescence，ECL)顯影，在PVDF

23、膜上面覆蓋X-線膠片，根據(jù)發(fā)光情況曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘，沖洗膠片。Quantity One軟件分析條帶強度。
　　 3.10統(tǒng)計學(xué)分析
　　 至少三次獨立重復(fù)實驗的結(jié)果用均數(shù)±標準差來表示。兩個樣本之間均數(shù)的比較用Student'st檢驗，多組進行統(tǒng)計比較使用單向方差分析(ANOVA)，多重比較用最小顯著差異法(LSD)。結(jié)果分析P＜0.05代表有統(tǒng)計學(xué)差異，實驗結(jié)果均由SPSS13.0軟件統(tǒng)計。
　　 四、實驗結(jié)果

24、
　　 4.1小細胞肺癌細胞株的藥物和放射敏感性
　　 為了確定小細胞肺癌細胞對化療藥物的敏感性，CCK-8法評價了細胞對阿霉素，順鉑和依托泊苷的IC50值。與H69、H446細胞相比，H69AR細胞對藥物的IC50值顯著增加(P＜0.05)。說明耐藥株H69AR細胞對多種藥物耐受。
　　 CCK-8法研究小細胞肺癌細胞的放射敏感性。4個劑量(分別2，4，6和8Gy)放射細胞。與H69AR細胞相比，H69或H44

25、6細胞在任何放射劑量時的存活率顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果表明耐藥株H69AR細胞對放射抵抗。
　　 4.2比較小細胞肺癌細胞中GnT-Ⅴ的表達
　　 qRT-PCR法和Western Blot法評估了H69AR、H69細胞和H446細胞中GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示與H69或H446細胞相比，H69AR細胞中GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)。
　　 H69AR細胞高表達

26、GnT-Ⅴ和對放化療抵抗，這表明GnT-Ⅴ可能參與小細胞肺癌的放化療抵抗。
　　 4.3通過GnT-Ⅴ shRNA建立低表達GnT-Ⅴ的H69AR
　　 為了進一步研究GnT-Ⅴ在H69AR細胞中放射抵抗性的作用，建立了低表達GnT-Ⅴ的H69AR細胞。pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ/N，pGPU6/GFP/NeoGnT-Ⅴ/1564和pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ/2224轉(zhuǎn)染入H69AR細胞。G418

27、篩選1個月得到轉(zhuǎn)染的細胞(H69AR GnT-Ⅴ/NC， H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69ARGnT-Ⅴ/2224)。熒光顯微鏡顯示，轉(zhuǎn)染細胞發(fā)出綠色熒光。
　　 在H69AR和H69AR GnT-Ⅴ/NC細胞中，GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白的表達均無顯著性差異。qRT-PCR的結(jié)果顯示，與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，干擾GnT-Ⅴ表達的H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞株GnT-

28、Ⅴ的mRNA表達被抑制，表達分別降低了(62.00±4.35)％和(73.12±3.52)％。Western Blot法檢測顯示，與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞的GnT-Ⅴ的蛋白表達均被抑制，表達量分別降低了(68.24±3.53)％和(76.52±4.67)％。在mRNA和蛋白水平都已證實，與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，H69AR GnT-Ⅴ/1564和

29、H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞的GnT-Ⅴ表達均降低。
　　 4.4抑制GnT-Ⅴ使H69AR細胞對化療藥和放射敏感
　　 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后的H69AR對化療藥物的存活。與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，H69AR GnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞對化療藥物的生長抑制的IC50值更小(P＜0.05)。結(jié)果表明，下調(diào)GnT-Ⅴ使SCLC細胞對化療藥物敏感。
　　 CCK-8法

30、檢測H69AR GnT-Ⅴ/NC、H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69ARGnT-Ⅴ/2224的細胞放射敏感性。4個劑量(分別為2，4，6和8Gy)放射細胞。與對照細胞相比，在任何照射劑量時，H69AR GnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224的細胞存活率顯著減少(P＜0.05)。這些結(jié)果表明下調(diào)GnT-Ⅴ后小細胞肺癌的放射敏感性提高了。
　　 4.5下調(diào)GnT-Ⅴ增強體內(nèi)細胞的放射敏感性
　　 體內(nèi)試

31、驗進一步研究GnT-Ⅴ在腫瘤生長和放射敏感性上的效應(yīng)。在BALB/cnu/nu鼠皮下接種1.0×107個細胞后，通過測量腫瘤大小評估H69AR，H69和H446的成瘤性。與相應(yīng)的非放射組相比，放射組的小細胞肺癌細胞中的標化腫瘤體積都更小(P＜0.05)，但H69，H446細胞的減少程度比H69AR細胞更顯著(P＜0.05)。H69AR細胞比H69和H446細胞對放射的敏感性低。
　　 放射后腫瘤體積均更小(P＜0.05)。但H6

32、9AR GnT-Ⅴ/1564或H69ARGnT-Ⅴ/2224細胞比H69AR GnT-Ⅴ/NC細胞的減少程度更顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明下調(diào)GnT-Ⅴ能提高H69AR在體內(nèi)的放射敏感性。
　　 4.6抑制GnT-Ⅴ增加放射誘導(dǎo)的G2-M期阻滯
　　 流式細胞儀評估小細胞肺癌的細胞周期差異。
　　 與相應(yīng)的非放射組相比，放射組H69AR，H69和H446細胞在G2-M期比例增加(P＜0.05)，但H69或H44

33、6細胞較H69AR細胞增加程度更顯著(P＜0.05)。
　　 與相應(yīng)的非放射組相比，放射組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GnT-Ⅴ的H69AR細胞在G2-M期的比例都增加了(P＜0.05)，但H69AR GnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，增加程度更顯著(P＜0.05)。這一結(jié)果表明，抑制GnT-Ⅴ增強放射引起的細胞周期進程中G2-M期阻滯。
　　 4.7 GnT-Ⅴ對放射誘導(dǎo)的凋亡和

34、凋亡蛋白表達的影響
　　 本研究通過進行下述實驗闡明GnT-Ⅴ對放射誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響:Hoechst33258染色，流式細胞術(shù)，TUNEL細胞凋亡原位檢測和Caspase-3活性檢測。
　　 Hoechst33258熒光染色法觀察到在放射后小細胞肺癌細胞中出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、熒光染色增強及凋亡小體形成。H69或H446細胞較H69AR細胞放射誘導(dǎo)的細胞凋亡現(xiàn)象更明顯。與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，H69AR GnT

35、-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224放射后觀察到更多的細胞凋亡。
　　 流式細胞儀檢測小細胞肺癌細胞株在不同劑量(0Gy、6Gy)射線放射后細胞的凋亡情況。細胞放射后凋亡均增加(P＜0.05)，然而增加程度不同。H69AR細胞
　　 比H69或H446細胞放射后的凋亡少，也少于H69AR GnT-Ⅴ/1564和H69ARGnT-Ⅴ/2224細胞(P＜0.05)。
　　 與流式細胞儀檢測結(jié)果一致，TUN

36、EL染色顯示與相應(yīng)非放射組相比，放射組細胞凋亡率均增加了(P＜0.05)。H69或H446細胞比H69AR細胞放射誘導(dǎo)更多的凋亡。H69AR GnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224較H69AR GnT-Ⅴ/NC放射后細胞凋亡率增加更顯著。
　　 Caspase-3在凋亡的終末執(zhí)行階段有重要作用。與對應(yīng)的非放射組相比，放射組H69AR、H69和H446細胞的Caspase-3活性分別增加了:(210.39±32.1

37、6)％，(499.93±42.74)％和(515.63±32.72)％(P＜0.05)。 H69AR GnT-Ⅴ/NC、H69ARGnT-Ⅴ/1564和H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞在放射后Caspases-3活性分別增加(225.47±27.84)％，(595.09±38.63)％和(609.12±20.28)％(P＜0.05)。這些結(jié)果均表明細胞在放射后Caspases-3活性顯著增加。H69或H446細胞較H69AR細胞放射

38、后Caspases-3活性增加更顯著。H69AR GnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，Caspases-3活性放射后增加更顯著。
　　 由于Bcl-2家族成員過度表達與放射耐受和凋亡相關(guān)，我們在體外和體內(nèi)檢測小細胞肺癌的Bcl-2、Bcl-xl和Bax在有或無放射時的表達水平。H69AR細胞較H69和H446細胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表達顯著升高，促凋亡蛋白

39、Bax略有下降。這些變化在放射后更明顯(P＜0.05)。為了進一步探討在細胞放射敏感性的改變中GnT-Ⅴ是否與Bcl-2家族密切相關(guān)，在體外和體內(nèi)，放射或不放射轉(zhuǎn)染的H69AR細胞后24小時，我們檢測這些蛋白的表達。在H69ARGnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224組，Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達水平明顯減少，而Bax略有增加，放射后的變化更明顯(P＜0.05)。但在H69AR GnT-Ⅴ/NC組有或無放射沒有顯著

40、差異。這些結(jié)果表明下調(diào)GnT-Ⅴ可能通過抑制Bcl-2和Bcl-xl及增強Bax的表達提高H69AR的放射敏感性。
　　 4.8 GnT-Ⅴ對放射誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的影響
　　 用NF-κB的熒光素酶報告基因研究小細胞肺癌細胞的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。共轉(zhuǎn)染pNF-κB Luc報告質(zhì)粒和pRL-CMV載體到小細胞肺癌細胞中，放射(0Gy，6Gy)后24小時收集細胞，熒光光度計檢測細胞中NF-κB的活性。根據(jù)研究結(jié)果，在

41、小細胞肺癌細胞系H69AR，H69，H446和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GnT-Ⅴ的H69ARGnT-Ⅴ/NC，H69AR GnT-Ⅴ/1564、H69AR GnT-Ⅴ/2224中，放射誘導(dǎo)NF-κB活性的增加（分別為4.60，2.35，2.26倍和4.50，1.87，1.65倍）。結(jié)果顯示在放射后，與H69和H446細胞相比，耐藥H69AR細胞的熒光素酶活性的值更高，說明NF-κB被激活增多。在H69AR細胞中下調(diào)GnT-Ⅴ后的H69AR GnT-Ⅴ/

42、1564、H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞放射后的熒光素酶活性的值較H69AR GnT-Ⅴ/NC明顯減少，說明NF-κB的激活被抑制。結(jié)果表明在耐藥細胞中下調(diào)GnT-Ⅴ后可以降低放射誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活。
　　 免疫熒光染色p65證實了上述結(jié)果。放射(0Gy，6Gy)后24小時收集SCLC細胞，p65免疫熒光染色研究放射引起p65移位到細胞核的效應(yīng)。放射后觀察到p65易位到細胞核表明NF-κB被激活。結(jié)果顯示H69

43、AR細胞比H69和H446細胞放射誘導(dǎo)更多的p65核易位，NF-κB被激活多。與H69AR GnT-Ⅴ/NC相比，在H69AR GnT-Ⅴ/1564或H69AR GnT-Ⅴ/2224細胞放射誘導(dǎo)的p65核易位減少，NF-κB活性被阻斷。這與NF-κB的雙熒光素酶報告基因檢測的結(jié)果一致。
　　 五、結(jié)論
　　 1.人小細胞肺癌耐藥細胞株H69AR具有多藥耐藥性和放射抵抗性。
　　 2.相對于小細胞肺癌細胞株H69和

44、H446，小細胞肺癌多藥耐藥細胞株H69AR中GnT-Ⅴ的水平顯著增高，靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表達質(zhì)?？梢韵抡{(diào)GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表達。
　　 3.下調(diào)H69AR中GnT-Ⅴ水平后，H69AR對化療藥和放射的敏感性顯著增加，進一步證實了GnT-Ⅴ有抵抗化療藥物和放射誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，并且在小細胞肺癌對藥物和放射耐受性產(chǎn)生過程中可能起到重要的作用。
　　 4.人小細胞肺癌耐藥細胞株H69AR對藥物和放射耐受