N-乙酰氨基葡萄糖-半乳糖核苷酸及類似物的酶法合成與應(yīng)用研究.pdf

1、糖類(包括單糖、寡糖和多糖)及糖綴合物廣泛存在于從低等的細菌到高等的動植物等所有生物體中，不僅是重要的結(jié)構(gòu)組分，而且作為信息分子在許多關(guān)鍵的生物過程中發(fā)揮著不可替代的作用。糖鏈結(jié)構(gòu)的特定改變與特定的病理狀態(tài)(如炎癥和腫瘤)密切相關(guān)，表明糖鏈在臨床診斷中的應(yīng)用潛力和作為藥物研發(fā)靶標(biāo)的可能性。
　　 N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)兩種N-乙酰氨基己糖是常見的單糖，它們是細菌細胞壁骨架和糖胺聚糖

2、的重要組分，也存在于糖蛋白、糖脂糖鏈的核心結(jié)構(gòu)中，還影響著分子間(如可通過蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)或細胞間(如GalNAc存在的糖脂影響細胞相互作用、細胞分化等過程)的相互作用。研究含有這兩種單糖的寡糖、多糖及糖綴合物，可以輔助人們了解生理、病理過程和研發(fā)藥物。
　　 細菌表面包被有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖，其中脂多糖(LPS)和莢膜多糖(CPS)均為共價連接于細胞表面，都由多個重復(fù)單元組成，都具有高度的結(jié)構(gòu)多樣

3、性，也都是細菌致病的重要的毒力因子。一些細菌的CPS還具有與人類自身的多糖相同或相似的結(jié)構(gòu)。研究這兩種細菌表面多糖及它們的生物合成過程，既有助于開發(fā)細菌感染性疾病的預(yù)防和治療方法，又有助于用低成本的方法生產(chǎn)無致病病毒污染的多糖。
　　 研究糖鏈的生物功能，就要獲得結(jié)構(gòu)均一且明確的含糖化合物。由于從生物來源分離的糖或糖綴合物的糖鏈結(jié)構(gòu)具有微不均一性，化學(xué)合成操作復(fù)雜、收率比較低，而生物體內(nèi)糖鏈合成途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶可以高效合成區(qū)位

4、特異性和立體特異性的糖苷鍵，所以用糖基轉(zhuǎn)移酶(主要是Leloir型糖基轉(zhuǎn)移酶)合成結(jié)構(gòu)均一的糖鏈已成為有機化學(xué)合成糖鏈的有效替代途徑。不過，有機化學(xué)合成在合成非天然糖方面具有優(yōu)勢，可以為天然化合物提供結(jié)構(gòu)多樣的衍生物，為藥物開發(fā)提供更多可能的靶標(biāo)；非天然糖也可能帶有易于進一步標(biāo)記的基團，可以促進對糖類代謝的研究。將化學(xué)合成的靈活性與酶法合成的高效高特異性結(jié)合(即化學(xué)酶法合成)，就有可能實現(xiàn)糖的結(jié)構(gòu)類似物的高效合成，是近年來廣泛應(yīng)用于糖生

5、物學(xué)研究領(lǐng)域的重要手段。
　　 糖核苷酸是單糖的異頭碳與核苷二磷酸或核苷一磷酸連接形成的衍生物，是單糖的活化形式。糖核苷酸作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的糖基供體，是生物體合成糖鏈和糖綴合物必需的前體；天然糖核苷酸的結(jié)構(gòu)類似物還可能作為酶的抑制劑或作為研究分析糖綴合物生物合成途徑的工具，因此，高效地制備天然和非天然的糖核苷酸對生物化學(xué)及藥物化學(xué)研究意義重大。生物體內(nèi)糖核苷酸的補救合成途徑步驟少，操作簡單，是酶法合成糖核苷酸常用的

6、合成路線。
　　 UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc分別是GlcNAc和GalNAc的糖基供體，在生物體內(nèi)，它們都可通過幾種途徑合成，也包括補救途徑。在補救途徑中，GalNAc可以在GalNAc1-位激酶和UDP-GalNAc焦磷酸化酶的先后作用下被轉(zhuǎn)化為UDP-GalNAc，以往的報道所用的酶都是來源于哺乳動物的。而GlcNAc要經(jīng)過GlcNAc激酶、GlcNAc磷酸變位酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶三個酶依次作用

7、，才被轉(zhuǎn)化為UDP-GlcNAc。缺少GlcNAc1-位激酶導(dǎo)致很難用酶法合成GlcNAc-1-P這一合成UDP-GlcNAc的關(guān)鍵中間體，也導(dǎo)致GlcNAc-1-P價格昂貴，還限制了GlcNAc-1-P結(jié)構(gòu)類似物的酶法合成，制約了以GlcNAc-1-P及其類似物為實驗材料的研究工作的開展。糖核苷酸也是價格昂貴的實驗材料，對研究有重要意義的糖核苷酸結(jié)構(gòu)類似物還無法從商業(yè)途徑獲得，因此，大量合成糖核苷酸及其結(jié)構(gòu)類似物也是糖生物學(xué)領(lǐng)域的一個

8、研究熱點。
　　 本論文的目標(biāo)之一是解決酶法合成GlcNAc/GalNAc-1-P及其結(jié)構(gòu)類似物的問題，并進而實現(xiàn)UDP-GlcNAc/GalNAc及其結(jié)構(gòu)類似物的酶法合成。來源于長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(NahK)是文獻中報道的第一個GlcNAc1-位激酶，可以將GlcNAc一步磷酸化成GlcNAc-1-P；它對GlcNAc和GalNAc具有相近的反應(yīng)速率，也可以看

9、作GalNAc1-位激酶，是第一個來源于細菌的具有該活性的酶；它對ManNAc也有一定活性，說明這個酶對底物結(jié)構(gòu)的要求比較寬松。論文第二章克隆了NahK，在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中以C端帶有His6標(biāo)簽的融合蛋白形式過量表達，經(jīng)過Ni柱和分子篩層析純化后，重組NahK純度可達到95％以上。我們綜合考慮了糖的側(cè)鏈基團的空間位阻、羥基的鍵型、脫氧，以及便于進一步反應(yīng)等因素，設(shè)計了C2-，C3-，C4-和

10、C6-位有結(jié)構(gòu)變化的GlcNAc/GalNAc結(jié)構(gòu)類似物，試驗NahK對它們的活性。包括GlcNAc和GalNAc在內(nèi)，一共試驗了25種糖，其中的19種被NahK轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的1-磷酸糖并用硅膠柱層析分離得到產(chǎn)物，收率達到60％以上的有14種。除了試驗NahK對GlcNAc/GalNAc結(jié)構(gòu)類似物的活性，γ位帶S原子的ATP也被用于NahK的反應(yīng)，且產(chǎn)物收率和ATP為磷酸供體時的收率相當(dāng)，說明這個S原子沒有對NahK的反應(yīng)產(chǎn)生太大影響。利

11、用NahK的反應(yīng)和硅膠層析法，GlcNAc-1-P的合成成本大大降低；而NahK表現(xiàn)出的廣泛的底物特異性又使它可以用于GlcNAc/GalNAc-1-P結(jié)構(gòu)類似物的制備，為UDP-GlcNAc/GalNAc結(jié)構(gòu)類似物的酶法合成奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章在第二章制備的1-磷酸糖的基礎(chǔ)上，克隆了來源于大腸桿菌的GlmU(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)和來源于人的AGX1(UDP-GalNAc焦磷酸化酶)，分別用大腸桿菌重組表達為N

12、端帶His6標(biāo)簽的融合蛋白。用Ni柱和分子篩層析純化后，兩種酶均有活性，但它們表現(xiàn)出不同的底物特異性。天然底物為GlcNAc-1-P的GlmU對試驗中用到的大部分GlcNAc構(gòu)型的糖-1-P衍生物具有活性，即使C2-位沒有酰胺基，在延長反應(yīng)時間時，也以中等收率合成出糖核苷酸。但它對GalNAc構(gòu)型的糖-1-P衍生物的活性有限，只對C4-和C6-位修飾的衍生物表現(xiàn)出一些活性。而對GalNAc-1-P的活性高于對GlcNAc-1-P的AGX

13、1對實驗用到的大多數(shù)GlcNAc/GalNAc-1-P結(jié)構(gòu)類似物表現(xiàn)出較高的活性。另外，含S原子的糖-1-P被GlmU轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的糖核苷酸，產(chǎn)物可以用于糖基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)的研究。利用離子交換和分子篩層析法，分離得到了UDP-GlcNAc/GalNAc及其結(jié)構(gòu)類似物，它們可以用于糖基轉(zhuǎn)移酶等酶的性質(zhì)研究和糖鏈結(jié)構(gòu)類似物的制備，而且建立了一種比較簡便的制備非天然糖核苷酸的方法。
　　 研究糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)，傳統(tǒng)的方法需要對待測分子進行放

14、射性或熒光標(biāo)記，還需要將分子分離出來才能檢測。在本論文第四章，我們建立了一種新的分析糖基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)的方法(SAMDIMS)。這種方法將自組裝單分子層(SAMs)和MALDI-TOF MS結(jié)合起來，不需要標(biāo)記待測分子，用較短時間、僅消耗微量樣品，即可通過反應(yīng)液的質(zhì)譜結(jié)果定性、定量地分析糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)。以來源于腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的β1，3-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶LgtA為例，用SAMDI MS

15、法分析了該酶的底物特異性，并測定了供體底物的動力學(xué)參數(shù)，展示了該方法在糖基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)研究中的應(yīng)用前景。
　　 GlcNAc/GalNAc存在于許多具有重要生理功能的糖結(jié)構(gòu)(如糖蛋白、肽聚糖和糖胺聚糖)中，越來越多的研究關(guān)注于利用化學(xué)修飾的非天然糖取代多糖中的GlcNAc/GalNAc殘基和調(diào)節(jié)這些糖苷的功能。論文第五章向大腸桿菌培養(yǎng)基中添加了2-ketoGlc(GlcNAc結(jié)構(gòu)類似物)，用可發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)的試劑在菌體表面和細

16、菌LPS核心寡糖中檢測到了含有酮基的糖，證明2-ketoGlc可以通過體內(nèi)整合到大腸桿菌的表面多糖中，從概念上證明了除了巖藻糖衍生物，其他特定的單糖衍生物也可以被整合入細菌表面的多糖。但由于2-ketoGlc有多種可能的代謝途徑，尚沒有精確地確定出核心寡糖中被修飾的殘基。透明質(zhì)酸(HA)在美容、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，對它的改造往往通過化學(xué)修飾進行。A型巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的CPS具有透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)，嘗試

17、用A型巴斯德氏菌的透明質(zhì)酸合酶(PmHAS)的可溶段為工具酶，以帶有生物正交基團的非天然糖核苷酸(UDP-2-ketoGlc)直接合成HA的衍生物?？赡苡捎跈z測方法靈敏度不高，或者UDP-2-ketoGlc無法被PmHAS(T)利用，在產(chǎn)物HA中沒有檢測到酮基。進一步的研究仍在進行中。
　　 總之，本論文應(yīng)用兩種來源于細菌的酶和一種來源于人的酶，建立了一種酶法合成、層析法分離制備UDP-GlcNAc/GalNAc及其結(jié)構(gòu)類似物的