α-N-乙酰半乳糖胺酶突變文庫的建立及篩選.pdf

1、α-N-乙酰半乳糖胺酶是血型轉(zhuǎn)換的工具酶，可以降解A型紅細胞表面抗原、消除其抗原抗體反應(yīng)，在輸血治療中，可以避免血型配型帶來的不便。本實驗室從報道的α-N-乙酰半乳糖胺酶中選取活性最好的酶，構(gòu)建α-N-乙酰半乳糖胺酶的原核表達載體，表達并純化α-N-乙酰半乳糖胺酶，檢測酶活性。利用定點突變技術(shù)，在關(guān)鍵位點進行突變，用高通量篩選技術(shù)篩選突變文庫，期望得到較高活性的α-N-乙酰半乳糖胺酶。本課題的研究工作主要包括以下兩部分：
　　

2、1.α-N-乙酰半乳糖胺酶的構(gòu)建
　　 為了建立新型α-N-乙酰半乳糖胺酶的篩選、檢測方法，我們提取腦膜金黃桿菌的基因組DNA，以此為模板PCR擴增出α-N-乙酰半乳糖胺酶(A4)。將A4克隆至pET-24a載體，轉(zhuǎn)化B121表達菌株進行蛋白表達。使用親和層析方法純化His-A4酶，選擇顯色底物驗證酶活性。同時，我們改進了傳統(tǒng)的ELISA方法，直接將紅細胞膜包被于ELISA檢測平板中，以紅細胞膜表面抗原作為直接底物，用ELISA

3、方法檢測酶活性。此研究建立了新型ELISA實驗方法，以此方法驗證了A4酶的活性，證明了此酶能夠有效降低紅細胞表面抗原抗體反應(yīng)，且具有濃度和時間依賴性。
　　 2.α-N-乙酰半乳糖胺酶突變文庫的篩選
　　 自然界中的α-N-乙酰半乳糖胺酶活性較低，不足以大規(guī)模生產(chǎn)酶用于通用型血的制備。在本實驗中，使用定點突變技術(shù)結(jié)合高通量篩選方法，期望得到活性較高的糖苷酶。我們突變了酶的6個氨基酸位點分別是96、98、179、181、2