N-糖酰胺酶F的性質(zhì)及脫糖基化作用的研究.pdf

1、N-糖酰胺酶F(Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigineamidase；PNGaseF；EC3.5.1.52)能夠在溫和的條件下從糖肽、糖蛋白上面完整切下N-連接的寡糖鏈(N-糖苷)，將寡糖鏈和蛋白部分分開(kāi)。糖酰胺酶F具有廣泛的底物專(zhuān)一性，對(duì)所有類(lèi)型的N-寡糖鏈都有作用。這些特性使糖酰胺酶F在糖鏈結(jié)構(gòu)分析、糖鏈在生物體內(nèi)的作用和糖鏈對(duì)糖蛋白的作用的研究中起到了重要的作用?，F(xiàn)在商業(yè)化

2、的N-糖酰胺酶F主要從腦膜炎膿桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)中提取。提取和純化N-糖酰胺酶F是一個(gè)十分耗費(fèi)和耗時(shí)的工作，因此市場(chǎng)價(jià)格十分昂貴，這大大限制了N-糖酰胺酶的廣泛利用和N-糖鏈大規(guī)模制備。 為了獲得大量廉價(jià)的N-糖酰胺酶F，本論文研究的主要內(nèi)容為根據(jù)目的基因N-糖酰胺酶F的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以Fmeningosepticum菌株的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；將所得的DNA片

3、段經(jīng)雙酶切后與載體pYD1質(zhì)粒進(jìn)行連接，然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，用Ampr篩選陽(yáng)性克隆并用雙酶切和PCR鑒定重組質(zhì)粒pYD1/PNGaseF。轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY100(Saccharomycescerevisiae)，N-糖酰胺酶F將通過(guò)酵母菌的分泌系統(tǒng)和Aga1-Aga2融合蛋白自動(dòng)連接到酵母菌細(xì)胞壁上，實(shí)現(xiàn)N-糖酰胺酶F的表達(dá)—純化—固定一步化。通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)證明N-糖酰胺酶F已經(jīng)成功的錨定在EBY100酵母細(xì)胞表面。經(jīng)流式細(xì)胞

4、儀(FACS)檢測(cè)，N-糖酰胺酶F細(xì)胞表面錨定率最大達(dá)到47％。通過(guò)摸索培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)首先在包含2％葡萄糖的YNB-CAA(0.67％YNB；0.5％Casaminoacids)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度達(dá)到OD600=2.2時(shí)，轉(zhuǎn)接到含有2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，使OD600=0.8；20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36h離心收集菌體，每升發(fā)酵液可獲得13g錨定有N-糖酰胺酶F的菌體。以糖蛋白R(shí)NaseB、IgG、人轉(zhuǎn)鐵蛋白為酶

5、反應(yīng)底物對(duì)表面錨定有N-糖酰胺酶F酵母細(xì)胞進(jìn)行酶活專(zhuān)一性試驗(yàn)，證明該固定化酶對(duì)三種類(lèi)型的糖蛋白都有作用。以糖蛋白R(shí)NaseB為酶反應(yīng)底物對(duì)該固定化酶的最優(yōu)溫度、pH、誘導(dǎo)條件進(jìn)行測(cè)定，確定最優(yōu)酶反應(yīng)條件為pH5.5，溫度為37℃，最佳誘導(dǎo)條件36h。 為了得到可溶性的N-糖酰胺酶F，將N-糖酰胺酶F基因重組到pET28a載體上，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量在30％以上。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，在34kD有一條目的帶。經(jīng)N