N-糖酰胺酶F的表達(dá)純化鑒定及Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SNAT1的多克隆抗體制備.pdf

1、N-糖酰胺酶F(PNGase F)主要是由革蘭氏陰性菌-腦膜炎膿桿菌分泌的一種分子量為34.8kDa的去糖基化酶。具有廣泛的底物專一性，對所有類型的N-連接的糖蛋白都有作用，能從糖蛋白完整切下N-寡糖鏈，其作用位點(diǎn)是N-乙酰葡萄糖胺殘基和天冬酰胺之間的價鍵結(jié)構(gòu)，同時將蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，生成的氨基寡糖鏈隨后水解成氨氣和寡糖。本研究首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出945bp的N-糖酰胺酶F基因，經(jīng)酶切、連接，構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體

2、pET28a-PNGase F。將pET28a-PNGase F轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，16℃誘導(dǎo)表達(dá)及Ni柱純化后，SDS-PAGE鑒定，獲得超過95％純度的可溶性表達(dá)的N-糖酰胺酶F。對以后N-糖酰胺酶F的相關(guān)研究起到了重要的推動作用。
　　鈉離子偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sodium-coupled Neutral Amino Acid Transporter，SNAT)屬于SLC38基因家族。SLC38家族又分為Syste

3、m A和System N兩個亞族，其中SNAT1和SNAT2屬于System A，SNAT3屬于System N，具有重要的生理功能，其功能紊亂可引起神經(jīng)退行性疾病。我們通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建了pBK-CMV△-SNAT3-HA重組質(zhì)粒，并通過Western blot技術(shù)證明SNAT3-HA融合蛋白正常表達(dá)，且能正常定位于細(xì)胞膜上。為了檢測純化的N-糖酰胺酶F脫糖基化功能，本文以SNAT1、SNAT2和SNAT3為底物，通過檢測它們經(jīng)N-

4、糖酰胺酶F消化后在SDS-PAGE中遷移率的變化來研究N-糖酰胺酶F的脫糖基化作用。證明我們純化的PNGase F具有高效的脫糖基化功能，同時證實(shí)了SNAT1、SNAT2和SNAT3分子中含有糖基化位點(diǎn)的假設(shè)。這對研究SNAT1、SNAT2和SNAT3的結(jié)構(gòu)與功能提供了有效的工具。
　　Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SNAT1被預(yù)測具有11個跨膜區(qū)域，其N端在細(xì)胞內(nèi)，C端在細(xì)胞外。本研究通過將潛在糖基化位點(diǎn)中的Asn突變成Gln，

5、利用Western-blot技術(shù)通過蛋白質(zhì)電泳遷移率的變化研究SNAT1中糖基化位點(diǎn)的數(shù)量及位置，證明了SNAT1中存在兩個糖基化位點(diǎn)，分別為N251和N257位。為SNAT1膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究起到了重要的輔助作用。
　　目前，還沒有特別適用的有效SNAT1特異性抗體，極大地阻礙了SNAT1結(jié)構(gòu)與功能的深入研究。本研究通過分子克隆的方法構(gòu)建了一個蛋白表達(dá)載體pET28a-SNAT1-75aa，通過誘導(dǎo)表達(dá)純化后，將SNAT1