日本三角渦蟲DjINX-11蛋白多克隆抗體制備及鑒定.pdf

1、日本三角渦蟲屬扁形動物門渦蟲綱的一種淡水渦蟲，因其具有超強(qiáng)的再生能力，是研究動物再生的良好模式動物之一。渦蟲的再生是由其體內(nèi)唯一具有分裂增殖和分化能力的成體干細(xì)胞neoblasts介導(dǎo)的。因此，neoblasts生物學(xué)特性研究對揭示渦蟲再生及修復(fù)機(jī)制具有重要的意義，如何鑒別neoblasts是研究前提。早期neobalsts的鑒別主要依賴形態(tài)學(xué)特征—細(xì)胞呈圓形或橢圓型，體積較小，具有較大核質(zhì)比，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有不均勻分布的擬染色質(zhì)，形態(tài)學(xué)鑒

2、別對儀器設(shè)備要求較高，需要一定的經(jīng)驗，鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，無法對neoblasts進(jìn)行精細(xì)鑒別;隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，根據(jù)neoblasts是“渦蟲體內(nèi)唯一具有分裂增殖和分化能力的細(xì)胞”這一特征，采用細(xì)胞分裂過程中特異的分子作為neoblasts的特異性分子標(biāo)記，采用的方法一般為原位雜交或抗體介導(dǎo)的免疫組化，但這些分子標(biāo)記均為細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，操作過程繁瑣，所需時間長，對細(xì)胞損傷大。為簡化日本三角渦蟲neoblasts的標(biāo)記過程，建立簡便、快捷、

3、特異的標(biāo)記方法，本文選取neoblasts特異性間隙連接蛋白DjINX-11為標(biāo)記的目標(biāo)蛋白，用DNASTAR Lasergene軟件和在線工具TMHMM Server v.2.0對DjINX-11的抗原性、親水性及跨膜域進(jìn)行分析，選擇該蛋白第1個胞外環(huán)中抗原性較強(qiáng)的序列（55-111位氨基酸）為靶序列，構(gòu)建該片段原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用終濃度為0.4 mM的IPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h，對誘導(dǎo)產(chǎn)的進(jìn)行SDS-PAGE分析

4、，純化抗原，制備相應(yīng)的多克隆抗體。通過細(xì)胞熒光實驗結(jié)合DjINX-11的編碼基因Djinx-11和neoblasts特異性標(biāo)志基因DjpiwiA雙色熒光原位雜交實驗對制備抗體的特異性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:所制備的多克隆抗體標(biāo)記的陽性細(xì)胞具有較大的核質(zhì)比，符合neoblasts的形態(tài)學(xué)特征;Djinx-11與DjpiwiA雙色熒光原位雜交顯示，DjpiwiA陽性細(xì)胞與Djinx-11陽性細(xì)胞完全重疊，Djinx-11陽性細(xì)胞中僅部分細(xì)胞為D