抗人MMP-11多克隆抗體制備及檢測(cè)月經(jīng)血初探.pdf

1、將已構(gòu)建好的重組的原核表達(dá)載體pGEX-5X-3/MMP-11轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶-11(matrixmetalloproteinase11，MMP-11)蛋白純化后免疫雌性新西蘭兔，制備抗MMP-11蛋白的多克隆抗體。通過免疫印跡(Westernblot)技術(shù)驗(yàn)證抗MMP-11蛋白多克隆抗體的特異性，用ELISA方法測(cè)定抗MMP-11蛋白多克隆抗體的效價(jià)。進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)染色方法探討該抗體區(qū)

2、分月經(jīng)血與外周血的可行性。以期為建立用MMP-11抗體快速、準(zhǔn)確檢測(cè)月經(jīng)血的免疫學(xué)方法提供建設(shè)性意見。解決法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中月經(jīng)血鑒定困難的現(xiàn)實(shí)問題，對(duì)于保護(hù)婦女權(quán)益及維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定等都具有極其重要的社會(huì)現(xiàn)實(shí)意義。 一、MMP-11蛋白的表達(dá)本試驗(yàn)首先制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將pGEX-5X-3/MMP-11轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α中，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)，挑選陽性克隆，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切法鑒定，獲得的質(zhì)粒DNA含MM

3、P-11基因片段。接著通過對(duì)不同異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)濃度(0.3mmol/L、0.6mmol/L、1.0mmol/L)、不同誘導(dǎo)時(shí)間(1h、2h、3h、4h、7h)和不同誘導(dǎo)溫度(30℃、37℃)下蛋白量表達(dá)的研究，選擇實(shí)驗(yàn)的最佳誘導(dǎo)條件為30℃誘導(dǎo)4h，IPTG濃度為1.0mmol/L。最后將誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白與標(biāo)準(zhǔn)抗MMP-11單克隆抗體進(jìn)行Western

4、blot分析，結(jié)果表明融合蛋白具有MMP-11抗原的特異性，分子量為45.5KD，符合預(yù)期結(jié)果。 二、抗MMP-11抗體制備將含有目的融合蛋白的菌液經(jīng)SDS-PAGE電泳，割取目的條帶，分別使用研磨后加佐劑免疫兔和直接免疫兔兩種方法，免疫5次后采集抗血清，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，用ELISA間接法測(cè)定抗血清效價(jià)達(dá)1∶12800。免疫印跡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明兩種免疫方法都可以獲得特異性抗MMP-11抗體。 三、月經(jīng)血檢測(cè)初

5、探取2名健康志愿者月經(jīng)周期第一、第二天月經(jīng)血及其靜脈血涂片，用自制抗血清作為第一抗體，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG為第二抗體，經(jīng)免疫組化染色表明，MMP-11蛋白存在于間質(zhì)細(xì)胞及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)；靜脈血涂片未見有MMP-11染色。1例子宮內(nèi)膜組織切片檢測(cè)結(jié)果可知，除了間質(zhì)細(xì)胞中可見MMP-11顆粒外，腺上皮細(xì)胞內(nèi)也富集了大量MMP-11蛋白顆粒。說明自制抗體能有效的檢測(cè)MMP-11，從而區(qū)分月經(jīng)血和靜脈血。 結(jié)論：從已構(gòu)建的重組原核