PCV2 Rep蛋白N-糖基化位點突變對病毒復(fù)制及致病性的影響.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）是一種無囊膜的單鏈負(fù)股環(huán)狀DNA病毒，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒粒子直徑為14~17nm，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒之一。1974年由德國學(xué)者Tischer等首次從豬腎傳代細(xì)胞（PK-15）中分離到的，1982年被命名為豬圓環(huán)病毒。豬圓環(huán)病毒分為兩個血清型：PCV1和PCV2。其中PCV2具有致病性，能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），皮炎和腎病綜合征（PDNS）等疾病，給

2、養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前該病毒已成為國內(nèi)外研究的熱點，但該病毒的致病機(jī)制目前尚未完全清楚。
　　豬圓環(huán)病毒2型主要有與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，與免疫原性相關(guān)的Cap蛋白及ORF3編碼的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白三種蛋白。其中Rep蛋白是PCV2復(fù)制的催化成分，對于Rep蛋白的深入研究，將有助于了解PCV2病毒的復(fù)制和致病機(jī)理。糖基化作為一種主要的翻譯后修飾對蛋白質(zhì)功能有著重要影響，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起著重要

3、的作用。50％以上的蛋白質(zhì)存在糖基化現(xiàn)象，其中Rep蛋白含有三個N-糖基化位點。
　　為了分析PCV2 Rep蛋白N-糖基化位點突變對病毒復(fù)制的影響，本研究擬在前期實驗室構(gòu)建好的單拷貝PCV2感染性克隆的基礎(chǔ)上，獲得三個單點突變和一個未突變的雙拷貝PCV2全長感染性克隆，分別命名為2M23、2M256、2M286、2PCV2，接種無污染的PK-15細(xì)胞，體外拯救突變體病毒。通過間接免疫熒光檢測病毒的拯救效果，TCID50測定病毒的

4、感染力，熒光定量PCR檢測細(xì)胞病毒的載量。結(jié)果顯示，PCV2 Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N-糖基化位點突變后降低病毒的復(fù)制能力而286～288aa突變后增強病毒的復(fù)制能力。
　　為深入了解PCV2 Rep蛋白N-糖基化位點突變對病毒復(fù)制和致病性的影響，在實驗室前期構(gòu)建好的平臺上，用2M23、2M256、2M286和2PCV2拯救病毒株分別對BALB/c小鼠進(jìn)行攻毒實驗，進(jìn)行抗體、病毒含量和免疫組織化學(xué)等的檢測